CRISPR: differenze tra le versioni
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Cas9 è una [[nucleasi]], un enzima specializzato nel taglio del DNA. Ha due siti attivi di taglio (HNH and RuvC), uno per ciascun filamento della [[doppia elica]] di DNA. Il team ha dimostrato che essi possono disabilitare uno o entrambi i siti mentre preservano la capacità di Cas9 a puntare sul suo DNA obiettivo. Jinek ha combinato tracrRNA e RNA spaziatore in un molecola di "RNA a guida singola" che, unita a Cas9, riusciva a trovare e tagliare i corretti DNA obiettivo. Jinek ''et al'' hanno proposto l'uso di questi [[RNA guida]] sintetici per l'[[editing genetico]]<ref name=craze/>. |
Cas9 è una [[nucleasi]], un enzima specializzato nel taglio del DNA. Ha due siti attivi di taglio (HNH and RuvC), uno per ciascun filamento della [[doppia elica]] di DNA. Il team ha dimostrato che essi possono disabilitare uno o entrambi i siti mentre preservano la capacità di Cas9 a puntare sul suo DNA obiettivo. Jinek ha combinato tracrRNA e RNA spaziatore in un molecola di "RNA a guida singola" che, unita a Cas9, riusciva a trovare e tagliare i corretti DNA obiettivo. Jinek ''et al'' hanno proposto l'uso di questi [[RNA guida]] sintetici per l'[[editing genetico]]<ref name=craze/>. |
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Nel 2012 si è avuta per la prima volta la prova che CRISPR potesse essere usato per [[ingegneria genetica]] e l'editing del genoma in [[colture cellulari]] [[uomo|umane]]<ref name=pmid22745249/><ref>{{cita news | url = http://www.independent.co.uk/news/science/crispr-gene-therapy-scientists-call-for-more-public-debate-around-breakthrough-technique-8927606.html | titolo = CRISPR gene therapy: Scientists call for more public debate around breakthrough technique | editore = [[The Independent]] | giorno = 7 | mese = novembre | anno = 2013 | accesso = 25 novembre 2013 | città = Londra | cognome = Connor | nome = Steve | lingua = en }}</ref> Da allora è stato impiegato in un ampio spettro di organismi tra cui il |
Nel 2012 si è avuta per la prima volta la prova che CRISPR potesse essere usato per [[ingegneria genetica]] e l'editing del genoma in [[colture cellulari]] [[uomo|umane]]<ref name=pmid22745249/><ref>{{cita news | url = http://www.independent.co.uk/news/science/crispr-gene-therapy-scientists-call-for-more-public-debate-around-breakthrough-technique-8927606.html | titolo = CRISPR gene therapy: Scientists call for more public debate around breakthrough technique | editore = [[The Independent]] | giorno = 7 | mese = novembre | anno = 2013 | accesso = 25 novembre 2013 | città = Londra | cognome = Connor | nome = Steve | lingua = en }}</ref> Da allora è stato impiegato in un ampio spettro di organismi tra cui il lievito di birra (''[[Saccharomyces cerevisiae]]'')<ref>{{cita pubblicazione | autore = DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM | titolo = Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems | rivista = [[Nucleic Acids Research]] | volume = 41 | numero = 7 | pagine = 4336–43 | mese = aprile | anno = 2013 | pmid = 23460208 | pmc = 3627607 | doi = 10.1093/nar/gkt135 | lingua = en }}</ref>, pesce zebra (''[[Danio rerio]]'')<ref>{{cite journal |vauthors = Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK|title = Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system|journal = [[Nat. Biotechnol.|Nature Biotechnology]]|volume = 31|issue = 3|pages = 227–9|date = March 2013|pmid = 23360964|pmc = 3686313|doi = 10.1038/nbt.2501}}</ref>, moscerino della frutta (''[[Drosophila melanogaster]]'')<ref>{{cite journal |vauthors = Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, O'Connor-Giles KM|title = Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease|journal = Genetics|volume = 194|issue = 4|pages = 1029–35|date = August 2013|pmid = 23709638|pmc = 3730909|doi = 10.1534/genetics.113.152710}}</ref>, [[axolotl]] (''A. mexicanum'')<ref>{{cite journal |vauthors = Flowers GP, Timberlake AT, McLean KC, Monaghan JR, Crews CM|title = Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease|journal = [[Dev.|Development]]|volume = 141|issue = 10|pages = 2165–71|date = May 2014|pmid = 24764077|pmc = 4011087|doi = 10.1242/dev.105072}}</ref>, [[nematodi]] (''[[Caenorhabditis elegans]]'')<ref>{{cite journal |vauthors = Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiácovo MP, Church GM, Calarco JA|title = Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system|journal = [[Nature Methods]]|volume = 10|issue = 8|pages = 741–3|date = August 2013|pmid = 23817069|pmc = 3822328|doi = 10.1038/nmeth.2532}}</ref>, [[piante]]<ref>{{cite journal |vauthors = Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP|title = Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice|journal = [[Nucleic Acids Research]]|volume = 41|issue = 20|pages = e188|date = November 2013|pmid = 23999092|pmc = 3814374|doi = 10.1093/nar/gkt780}}</ref>, [[topi]]<ref name="pmid23643243">{{cite journal |vauthors = Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R|title = One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering|journal = Cell|volume = 153|issue = 4|pages = 910–918|date = May 2013|pmid = 23643243|pmc = |doi = 10.1016/j.cell.2013.04.025}}</ref> [[scimmie]]<ref>{{Cite journal|title = Targeted genome editing in primate embryos|date = 2 June 2015|journal = [[Cell Res.|Cell Research]]|doi = 10.1038/cr.2015.64|pmid = 26032266|access-date = |vauthors = Xiangyu G, Xiao-Jiang L}}</ref>, [[embrione umano|embrioni umani]] non vitali <ref name="SCI-20150319"/>, e altri organismi viventi. |
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Inoltre, CRISPR è stato modificato per creare [[fattori di trascrizione]] programmabili che permettono agli scienziati di indirizzarsi verso specifici geni bersaglio da silenziare o attivare<ref name="PMID 24136345">{{cita pubblicazione | autore = Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS| titolo = CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression | rivista = [[Nature Protocols]] | volume = 8 | numero = 11 | pagine = 2180–96 | mese = novembre | anno = 2013 | pmid = 24136345 | doi = 10.1038/nprot.2013.132 }}</ref>. |
Inoltre, CRISPR è stato modificato per creare [[fattori di trascrizione]] programmabili che permettono agli scienziati di indirizzarsi verso specifici geni bersaglio da silenziare o attivare<ref name="PMID 24136345">{{cita pubblicazione | autore = Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS| titolo = CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression | rivista = [[Nature Protocols]] | volume = 8 | numero = 11 | pagine = 2180–96 | mese = novembre | anno = 2013 | pmid = 24136345 | doi = 10.1038/nprot.2013.132 }}</ref>. |
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=== Predecessori === |
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Nei primi [[anni 2000]], la ricerca aveva sviluppato la [[nucleasi a dito di zinco|nucleasi]] a [[dita di zinco]], proteine sintetiche i cui [[DNA-binding domain]]s permettono loro di creare rotture del doppio filamento del DNA in specifici punti. Nel 2010, le nucleasi sintetiche chiamate [[TALEN]] (''Transcription activator-like effector nuclease'') hanno fornito un modo più facile per indirizzare la rottura del doppio filamento verso una posizione specifica della catena del DNA. Sia la nucleasi a dita di zinco, sia le TALEN, richiedono ai ricercatori di creare una proteina personalizzata per ciascuna sequenza di DNA che si intende comlpire, che è un processo più difficoltoso e che necessità più tempo rispetto agli RNA guida. I CRISPRs sono molto più facili da progettare perché essi creano una breve sequenza di RNA che è associata alla sequenza bersaglio del DNA, una cosa più semplice rispetto a ingegnerizzare un'intera proteina personalizzat<ref name = MIT>{{ |
Nei primi [[anni 2000]], la ricerca aveva sviluppato la [[nucleasi a dito di zinco|nucleasi]] a [[dita di zinco]], proteine sintetiche i cui [[DNA-binding domain]]s permettono loro di creare rotture del doppio filamento del DNA in specifici punti. Nel 2010, le nucleasi sintetiche chiamate [[TALEN]] (''Transcription activator-like effector nuclease'') hanno fornito un modo più facile per indirizzare la rottura del doppio filamento verso una posizione specifica della catena del DNA. Sia la nucleasi a dita di zinco, sia le TALEN, richiedono ai ricercatori di creare una proteina personalizzata per ciascuna sequenza di DNA che si intende comlpire, che è un processo più difficoltoso e che necessità più tempo rispetto agli RNA guida. I CRISPRs sono molto più facili da progettare perché essi creano una breve sequenza di RNA che è associata alla sequenza bersaglio del DNA, una cosa più semplice rispetto a ingegnerizzare un'intera proteina personalizzat<ref name = MIT>{{cita pubblicazione | cognome = Young | first = nome | url=http://www.technologyreview.com/review/524451/genome-surgery | titolo = CRISPR and Other Genome Editing Tools Boost Medical Research and Gene Therapy’s Reach | rivista = [[MIT Technology Review]] | editore = [[Massachusetts Institute of Technology]] | città = Cambridge, Massachusetts | giorno = 11 | mese = febbraio | anno = 2014 | accesso = 13 aprile 2014 }}</ref>. |
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== Struttura dei ''loci'' == |
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=== Ripetizioni e spaziatori === |
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== Note == |
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Versione delle 07:45, 16 ott 2015
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats; al plurale, nella letteratura scientifica in lingua inglese, CRISPRs) è il nome attribuito a segmenti di DNA contenenti brevi sequenze ripetute, scoperti all'interno di cellule procariote (in passato, la terminologia era Short Regularly Spaced Repeats, abbreviato in SRSR). Ogni ripetizione è seguita da brevi frammenti di DNA "distanziatore" generato dalla precedente esposizione del batterio a virus batteriofagi o plasmidi[1] Il termine viene pronunciato "crisper"[2]. Le sequenze CRISPR sono state rinvenute in circa il 40% dei genomi batterici e nel 90% dei genomi degli Archea sottoposti a sequenziamento[3].
Si è scoperto, inoltre, l'esistenza di un complesso di geni associati a tali sequenze, denominato Cas (contrazione di CRISPR-associated), in grado di codificare per presunte proteine di nucleasi ed elicasi, che sono enzimi in grado di tagliare il DNA. In questo modo, l'associazione CRISPR/Cas costituisce un sistema immunitario procariotico che conferisce resistenza nei confronti di elementi genetici estranei come plasmidi e fagi[4][5] e provvede, quindi, a una sorta di immunità acquisita. Le sequenze "distanziatrici" dei CRISPR riconoscono e tagliano questi elementi estranei con un meccanismo analogo alla RNA interference degli organismi eucariotici[1].
Per queste sue caratteristiche, il sistema CRISPR/Cas è stato usato per l'ingegneria genetica (aggiungendo, rimuovendo o cambiando la sequenza di geni specifici) e per la regolazione genica di molte specie[6]. Portando la proteina Cas9 e gli appropriati RNA guida (gRNA) nelle cellule, il genoma dell'organismo può essere tagliato in qualsiasi punto in maniera estremamente precisa e con una tecnica semplice che richiede attrezzature relativamente economiche[7].
Inoltre, CRISPR è stato modificato per creare fattori di trascrizione programmabili che permettono di attivare o silenziare specifici geni[8].
Storia della scoperta
CRISPR fa parte di un processo biologico che, sebbene oggetto di studi solo negli ultimi decenni del XX secolo, appare di norma nei batteri: questi, infatti, possono incorporare nella cellula, in altre circostanze, frammenti di DNA estranei al genoma originario e perfino raccattare DNA danneggiato dall'ambiente esterno[10]
Cluster ripetuti sono stati descritti per la prima volta nel 1987 per il batterio Escherichia coli a opera di Yoshizumi Ishino, ma a quell'epoca la loro funzione non era conosciuta[11] Nel 2000 furono identificate simili ripetizioni in altri batteri e bacteria archaea e furono denominate Short Regularly Spaced Repeats (SRSR)[12]. Gli SRSR furono rinominati in CRISPR nel 2002[13]. Si è scoperto che un insieme di questi geni è associato con le ripetizioni CRISPR: i componenti di tale insieme sono stati chiamati geni cas (CRISPR-associated). I geni cas codificano per presunte proteine di nucleasi o elicasi, che sono enzimi in grado di tagliare il DNA[13].
Nel 2005, tre gruppi di ricerca indipendenti mostrarono che alcuni spaziatori di CRISPR provenivano da DNA di fagi e da DNA extracromosomico come plasmidi[14][15][16]. In effetti, gli spaziatori sono frammenti di DNA raccolti da virus che, in precdenza, avevano cercato di attaccare la cellula. La provenienza degli spaziatori era il segno di un ruolo che il sistema CRISPR/cas aveva nella immunità adattativa nei batteri[9][17]. Koonin e colleghi hanno proposero che gli spaziatori funzionassero come un modello per le mlecole di RNA, analogo a un sistema chiamato RNA interference usato nelle cellule eucariote[18].
Nel 2007, Barrangou e Horvath (ricercatori dell'industria alimentare, alla Danisco), insieme al gruppo di Moineau all'Université Laval (Canada), mostrarono che potevano usare DNA spaziatore per alterare la resistenza dello Streptococcus thermophilus agli attacchi dei fagi[18].
Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, in modo indipendente, hanno sfruttato le proteine associate a CRISPR per capire come i batteri usano gli spaziatori nelle loro difesa immunitaria[19] Hanno studiato in modo congiunto un più semplice sistema CRISPR che si affida a una proteina chiamata Cas9. Hanno scoperto che il batterio risponde a un fago invasore trascrivendo gli spaziatori e le sequenze palindromiche di DNA in una lunga molecola di RNA. La cellula, allora, usa crRNA transattivante (tracrRNA-trans-activating crRNA) e Cas9 per tagliare questa lunga molecola di RNA molecole in pezzi chiamati crRNAs[18].
Cas9 è una nucleasi, un enzima specializzato nel taglio del DNA. Ha due siti attivi di taglio (HNH and RuvC), uno per ciascun filamento della doppia elica di DNA. Il team ha dimostrato che essi possono disabilitare uno o entrambi i siti mentre preservano la capacità di Cas9 a puntare sul suo DNA obiettivo. Jinek ha combinato tracrRNA e RNA spaziatore in un molecola di "RNA a guida singola" che, unita a Cas9, riusciva a trovare e tagliare i corretti DNA obiettivo. Jinek et al hanno proposto l'uso di questi RNA guida sintetici per l'editing genetico[18].
Nel 2012 si è avuta per la prima volta la prova che CRISPR potesse essere usato per ingegneria genetica e l'editing del genoma in colture cellulari umane[20][21] Da allora è stato impiegato in un ampio spettro di organismi tra cui il lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae)[22], pesce zebra (Danio rerio)[23], moscerino della frutta (Drosophila melanogaster)[24], axolotl (A. mexicanum)[25], nematodi (Caenorhabditis elegans)[26], piante[27], topi[28] scimmie[29], embrioni umani non vitali [30], e altri organismi viventi.
Inoltre, CRISPR è stato modificato per creare fattori di trascrizione programmabili che permettono agli scienziati di indirizzarsi verso specifici geni bersaglio da silenziare o attivare[8].
Sono disponibili librerie di decine di migliaia di RNA guida[18].
Predecessori
Nei primi anni 2000, la ricerca aveva sviluppato la nucleasi a dita di zinco, proteine sintetiche i cui DNA-binding domains permettono loro di creare rotture del doppio filamento del DNA in specifici punti. Nel 2010, le nucleasi sintetiche chiamate TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) hanno fornito un modo più facile per indirizzare la rottura del doppio filamento verso una posizione specifica della catena del DNA. Sia la nucleasi a dita di zinco, sia le TALEN, richiedono ai ricercatori di creare una proteina personalizzata per ciascuna sequenza di DNA che si intende comlpire, che è un processo più difficoltoso e che necessità più tempo rispetto agli RNA guida. I CRISPRs sono molto più facili da progettare perché essi creano una breve sequenza di RNA che è associata alla sequenza bersaglio del DNA, una cosa più semplice rispetto a ingegnerizzare un'intera proteina personalizzat[31].
Struttura dei loci
Ripetizioni e spaziatori
I loci CRISPR hann una lunghezza che può variare da 24 a 48 coppie di basi[32] ed eseibiscono, di solito, una qualche simmetria diadica, il che implica la formazione di una struttura secondaria quali forcine da capelli, ma non sono realmente palindrome[33]. Le ripetizioni sono spearate da distanziatori di lunghezza simile[32]. Alcune sequenze spaziatrici CRISPR corrispondono in modo esatto a sequenze da plasmidi and fagi[14][15][16] sebbene qualche spaziatore coincide con il genoma procariotico (self-targeting spacers)[14][34]. Nuovi spaziatrori possono essere rapidamente aggiunti come parte della risposta immunitaria a infezioni di fagi[35].
Note
- ^ a b c Marraffini LA, Sontheimer EJ, CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea, in Nature Reviews Genetics, vol. 11, n. 3, marzo 2010, pp. 181–190, DOI:10.1038/nrg2749, PMC 2928866, PMID 20125085.
- ^ Eric Sawyer, Editing Genomes with the Bacterial Immune System, su Scitable, Nature Publishing Group, 9 febbraio 2013. URL consultato il 6 aprile 2015.
- ^ a b Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C, The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats, in BMC Bioinformatics, vol. 8, 2007, p. 172, DOI:10.1186/1471-2105-8-172, PMC 1892036, PMID 17521438.
- ^ Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P, CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes, in Science, vol. 315, n. 5819, marzo 2007, pp. 1709–1712, DOI:10.1126/science.1138140, PMID 17379808.
- ^ Marraffini LA, Sontheimer EJ, CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA, in Science, vol. 322, n. 5909, dicembre 2008, pp. 1843–1845, DOI:10.1126/science.1165771, PMC 2695655, PMID 19095942.
- ^ Mali P, Esvelt KM, Church GM, Cas9 as a versatile tool for engineering biology, in Nature Methods, vol. 10, n. 10, ottobre 2013, pp. 957–63, DOI:10.1038/nmeth.2649, PMC 4051438, PMID 24076990.
- ^ Hendel A, Bak RO, Clark JT, Kennedy AB, Ryan DE, Roy S, Steinfeld I, Lunstad BD, Kaiser RJ, Wilkens AB, Bacchetta R, Tsalenko A, Dellinger D, Bruhn L, Porteus MH, Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells, in Nature Biotechnology, giugno 2015, DOI:10.1038/nbt.3290, PMID 26121415.
- ^ a b Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS, CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression, in Nature Protocols, vol. 8, n. 11, novembre 2013, pp. 2180–96, DOI:10.1038/nprot.2013.132, PMID 24136345.
- ^ a b Horvath P, Barrangou R, CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea, in Science, vol. 327, n. 5962, 2010, pp. 167–70, DOI:10.1126/science.1179555.
- ^ Overballe-Petersen S, Harms K, Orlando LA, Mayar JV, Rasmussen S, Dahl TW, Rosing MT, Poole AM, Sicheritz-Ponten T, Brunak S, Inselmann S, de Vries J, Wackernagel W, Pybus OG, Nielsen R, Johnsen PJ, Nielsen KM, Willerslev E, Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA, in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 110, n. 49, dicembre 2013, pp. 19860–5, DOI:10.1073/pnas.1315278110.
- ^ Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A, Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product, in Journal of Bacteriology, vol. 169, n. 12, dicembre 1987, pp. 5429–5433.
- ^ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G, Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria, in Molecular microbiology, vol. 36, n. 1, April 2000, pp. 244–246, DOI:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x.
- ^ a b Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM, Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes, in Molecular microbiology, vol. 43, n. 6, March 2002, pp. 1565–1575, DOI:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x.
- ^ a b c Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G, CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies, in Microbiology, vol. 151, Pt 3, marzo 2005, pp. 653–663, DOI:10.1099/mic.0.27437-0.
- ^ a b Template:Cita pubblicaizone
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- ^ Morange, M, What history tells us XXXVII. CRISPR-Cas: The discovery of an immune system in prokaryotes, in Journal of Biosciences, vol. 2, n. 2, giugno 2015, pp. 221–223, DOI:10.1007/s12038-015-9532-6.
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- ^ (EN) Andrew Pollack, Jennifer Doudna, a Pioneer Who Helped Simplify Genome Editing, in The New York Times, 11 maggio 2015. URL consultato il 12 maggio 2015.
- ^ Errore nelle note: Errore nell'uso del marcatore
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- ^ (EN) Steve Connor, CRISPR gene therapy: Scientists call for more public debate around breakthrough technique, Londra, The Independent, 7 novembre 2013. URL consultato il 25 novembre 2013.
- ^ (EN) DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM, Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems, in Nucleic Acids Research, vol. 41, n. 7, aprile 2013, pp. 4336–43, DOI:10.1093/nar/gkt135, PMC 3627607, PMID 23460208.
- ^ Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK, Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system, in Nature Biotechnology, vol. 31, n. 3, March 2013, pp. 227–9, DOI:10.1038/nbt.2501.
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Voci correlate
Collegamenti esterni
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