MicroRNA

Da Wikipedia, l'enciclopedia libera.
Struttura secondaria di un precursore miRNA di Brassica oleracea, modellato digitalmente

I microRNA, acronimo: miRNA, sono piccole molecole endogene di RNA non codificante, a singolo filamento.
Trattasi di polimeri di 20-22 nucleotidi, principalmente attivi nella regolazione trascrizionale e post-trascrizionale dell'espressione genica, codificate dal DNA nucleare eucariotico. I miRNA funzionano tramite accoppiamento-base con sequenze complementari delle molecole di RNA messaggero (mRNA), solitamente con conseguente silenziamento genico tramite repressione traduzionale o degradazione della molecola bersaglio.
I microRNA fanno parte di una più grande rete di geni regolatori e svolgono diverse funzioni. La più nota, attualmente, è appunto quella di regolazione post-trascrizionale, in cui vanno a inibire la traduzione di determinati RNA messaggeri. I microRNA non devono essere confusi con i citati RNA messaggeri, la cui grafia della sigla è molto simile.

Contesto biomolecolare[modifica | modifica wikitesto]

Nei vertebrati i miRNA costituiscono circa l’1% di tutti i geni. Essi rappresentano una classe di piccoli RNA che, oltre ai microRNA, comprende anche gli Short interfering RNA (siRNA), i Piwi RNA (piRNA), i Trans-acting siRNA (tasiRNA), i Small-scan RNA (scnRNA) e i Repeat-associated siRNA (rasiRNA). Le prime due molecole sono ampiamente presenti in natura e derivano da precursori a doppio filamento.
I PiwiRna sono molto presenti negli animali e sembrano derivare da precursori a singolo filamento, anche se per questi si hanno poche informazioni. I microRNA sono, per la maggior parte, ampiamente caratterizzati nelle piante e nei nematodi (dove sono stati osservati per la prima volta) e differiscono tra loro per sequenza, quantità, pattern di espressione e localizzazione genomica. I miRNA provengono da precursori più grandi, rispetto ai loro 20-22 nucleotidi, trascritti, o da geni non codificanti proteine che hanno un proprio locus genico, o contenuti all’interno di regioni introniche di altre sequenze codificanti. Questi trascritti contengono sequenze che formano strutture a forcina che vengono processate dalle proteine nucleari Dicer, (endoribonucleasi Rnasi III che taglia la forcina del pre-miRNA - o nelle piante DCL1, proteina simile a Dicer). I miRNA portano alla distruzione (in genere nelle piante) o alla repressione della traduzione (nei nematodi e negli altri animali studiati) di quegli mRNA bersaglio che hanno una sequenza complementare nella loro regione non codificante 3' (3'-UTR) a valle del codone di stop.

Breve storia sulle origini[modifica | modifica wikitesto]

Per molti decenni i miRNA sono sfuggiti ai ricercatori, tuttavia, a partire dal 1993, sono stati scoperti nel nematode Caenorhabditis elegans , da Victor Ambros durante lo studio di mutazioni che determinavano cambiamenti nella tempistica dello sviluppo dell'animale.
Nel corso di questi studi è stato infatti individuato mediante screening genetico il gene “lin-4” che codificava per due piccoli RNA: uno di circa 22 nucleotidi e l’altro di 61 nucleotidi. Quest’ultimo rappresenta il precursore del più corto. Inoltre lin-4 mostrava una complementarità antisenso per diversi siti a livello della regione 3’UTR del gene lin-14. Si è osservato che Lin-4 in sostanza regolava Lin-14, riducendo la quantità di proteina prodotta senza modificare i livelli di messaggero (V. Ambros, 1993). Da allora, l’RNA Lin-4 di 22 nucleotidi è stato riconosciuto come capostipite di un’ampia classe di RNA regolatori chiamata “microRNA” o “miRNA”. Nel 2000, è stato individuato nel C. elegans un altro gene "let-7", codificante per un secondo miRNA di circa 22 nucleotidi, coinvolto nella transizione dallo stato larvale a quello adulto; omologhi del gene let-7 vennero in seguito scoperti anche nell'uomo e nei ditteri. Solo un anno dopo, vennero identificati oltre 100 miRNA, dei quali 20 in Drosophila, 30 nell'uomo e 60 nei nematodi.

Biogenesi dei miRNA[modifica | modifica wikitesto]

Al contrario dei siRNA (che possono derivare da trascritti di dsRna come: Rna virali, Rna hairpin, trasposoni, centromeri, trascritti antisenso più trascritti senso di geni affini), i miRNA derivano da trascritti di sequenze codificate da geni autonomi oppure inclusi in introni di altri geni. I miRNA appena trascritti si presentano come sequenze di dsRNA con struttura secondaria (stem-loop) chiamate pri-miRNA ad opera della RNA polimerasi II, o più raramente della RNA polimerasi III. I pri-miRNA sono molecole grandi anche migliaia di nucleotidi che subiscono l'aggiunta del cappuccio metilico e poliadenilazione, capping e presumibilmente splicing lo splicing degli introni. I pri-miRNA vengono poi processati da apposite RNAsi di tipo III chiamate Drosha (per gli animali e Dcl1 per le piante) e Pasha, in un complesso con la proteina legante l’RNA DGCR8 (il complesso Microprocessore) generando in questo modo molecole lunghe 70-80 nucleotidi con struttura a forcina (il miRNA funzionale è contenuto in uno dei due bracci) ed estremità 3' protrudenti di due nucleotidi, definite pre-miRNA. Tutti questi passaggi avvengono all'interno del nucleo. I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma grazie all'esportina 5 (una proteina localizzata sulla membrana nucleare), che media la loro traslocazione nel citoplasma per la recisione dell'ansa (Bartel, 2004) e quindi per la maturazione, attraverso un meccanismo Ran-GTP mediato. Nelle piante invece i due tagli avvengono entrambi nel nucleo. Nel citoplasma i pre-miRNA subiscono un riarrangiamento ulteriore ad opera di un particolare dominio della proteina Dicer (una endonucleasi RNasi III), denominato "Paz" (il quale riconosce le estremità 3'derivanti dal processamento di Drosha), creando così molecole a singolo filamento lunghe circa 21 nucleotidi che sono i miRNA maturi. Tale enzima risulta composto oltre che da "Paz" anche da altri domini come quello ATPasico/elicasico e DUF283, le cui funzioni non sono state ancora definite, mentre il centro catalitico di Dicer è formato da RIIIa e RIIIb ripetuti in tandem. Il dominio Paz si lega all’estremità del precursore, mentre i due domini RNasi III si legano preferenzialmente ad un filamento. L’enzima taglia entrambi i filamenti in intermedi di circa 21 nucleotidi lasciando un monofosfato all’estremità 5’ e un'estremità 3’, con il gruppo OH, protrudente di due nucleotidi. Alcuni miRNA vanno incontro ad un processamento Drosha indipendente (Bartel, 2007) o Dicer indipendente (Lai, 2010). Successivamente, i microRNA interagiscono in maniera specifica con le proteine Argonauta (sottofamiglia Ago) e sono incorporati in grandi complessi di ribonucleoproteine effettrici chiamati RISC. RISC sta per “complesso di silenziamento indotto da RNA” il cui centro catalitico è rappresentato dalle proteine Argonauta. Si tratta di proteine di circa 100 kDa, chiamate anche proteine "PPD" perché costituite dai domini PAZ e PIWI. È proprio il dominio PAZ della proteina Argonauta che prende contatto con il filamento 3’ protrudente mentre il filamento 5’ della stessa estremità contenente il fosfato viene legata dal dominio Mid. All’interno del RISC il doppio filamento di RNA viene svolto e questo porta alla selezione di uno dei due filamenti come miRNA maturo; mentre l’altro filamento viene rapidamente degradato. Nell'uomo possiamo trovarne almeno quattro Ago1-4, caratterizzate da ripetizioni ricche in glutammina all'estremità N-terminale; tra queste la più importante negli Eucarioti è Ago 2. È possibile che le proteine Argonauta competano con il fattore eIF4E per legare il cap, evitando così la formazione del complesso eIF4F sul cap al 5’, necessario per l’inizio della traduzione cap-dipendente (Hoff, 2008). Si è visto che un mRNA può essere riconosciuto e legato da diversi complessi miRNA-RISC, inoltre ciascun tipo di complesso miRNA-RISC può legarsi ad mRNA target diversi. Nelle piante, si è visto che il complesso costituito da RISC e miRNA si associa per complementarità perfetta alla CDS degli mRNA target causando il taglio dell'mRNA. Negli animali invece, si è visto che il complesso costituito da RISC e miRNA si associa per complementarità imperfetta alla 3'UTR dell'mRNA target, causando in questo modo il blocco della traduzione di quell'mRNA come conseguenza ad uno svolgimento impossibile dello stesso da parte di elicasi associate al ribosoma e alla sua catalisi.

A differenza della biogenesi, il decadimento dei miRNA è tuttora poco noto. Inizialmente si pensava che i miRNA fossero delle molecole molto stabili. Solo di recente sono stati individuati enzimi coinvolti nel turnover dei miRNA: SDN e XRN-2. I miRNA che hanno completato la loro attività o che non hanno un messaggero target si dissociano dal complesso RISC e sono destinati alla degradazione. In Arabidopsis sono state scoperte molecole di microRNA vegetali che presentano 2-5 residui di uracile al terminale 3’. Questi miRNA si legano a SDN; sono esonucleasi che catalizzano la degradazione del filamento di miRNA in direzione 3’-5’. Inoltre si è visto che la deplezione dei trascritti di SDN porta ad un incremento di miRNA maturi nella cellula. È stato dimostrato che l’estremità 3’ dei miRNA può subire delle modificazioni, in particolare sono stati identificati miRNA contenenti residui di uracile e miRNA contenenti gruppi metilici legati al 2’-O. Il significato di queste modificazioni è ancora da chiarire, tuttavia secondo un’ipotesi la presenza di residui di uracile potrebbe rappresentare un segnale che promuove la degradazione; mentre la metilazione impedirebbe l’aggiunta di uracile e quindi avrebbe un effetto protettivo nei confronti della degradazione. Tuttavia, in vitro i microRNA con attaccati residui di U, sono stati degradati in modo meno efficiente: quindi la presenza di U non è un segnale definitivo. Nelle cellule animali è l’esonucleasi 5’-3’ XRN-2 catalizza la degradazione dei miRNA maturi: Il miRNA rilasciato dal complesso RISC , si lega al miRISC: o È un cofattore o Si lega a sequenze che si estendono oltre l’estremità 5’ del miRNA o Funge da substrato per reclutare XRN-2. A questo punto XRN-2 degrada il miRNA. Normalmente Gld-2 è una poly A polimerasi che catalizza l’aggiunta di residui di Adenina al terminale 3’ del messaggero. Nel miR-122, prodotto dal fegato, GLD-2 aggiunge un singolo residuo di Adenina al terminale 3’ che stabilizza la molecola miR-122. Così XRN-2 non può demolire il miR-122.

Funzioni[modifica | modifica wikitesto]

Inizialmente si pensava che i miRNA potessero diminuire l’espressione delle proteine, soltanto attraverso l’inibizione della traduzione dell'mRNA target. Recenti studi hanno invece indicato che tanti miRNA possono indurre una rapida degradazione degli mRNA target, riducendo indirettamente la quantità di proteina prodotta. Sono stati individuati almeno due modi generali di down-regulation, mediati dai miRNA nelle cellule dei Metazoi: la repressione della traduzione e la degradazione dell’RNA messaggero. Il meccanismo della repressione traduzionale mediato dai miRNA è ancora una questione controversa. Si ipotizza che i miRNA inibiscano l’inizio della traduzione, oppure una fase di “post-inizio” nella sintesi proteica, determinando la degradazione co-traduzionale del peptide nascente. Come accennato precedentemente, in alcuni casi i miRNA possono provocare la degradazione dell’mRNA attraverso la deadenilazione. Un quadro generale del decadimento dell’RNA mediato dal miRNA (NMD, "Nonsense-mediated decay") sembra emergere da recenti studi su cellule di D. melanogaster, embrioni di Zebrafish, Saccharomyces cerevisiae e cellule umane, nelle quali gli mRNA legati dai miRNA subiscono una precedente deadenilazione prima di essere degradati. Nello Zebrafish, il miRNA miR-430 conduce diverse centinaia di mRNA materni al decadimento tramite una rapida deadenilazione: questa distruzione massiva degli mRNA materni è necessaria per silenziare l’espressione dell’mRNA materno in modo che lo sviluppo dell’embrione dello zebrafish possa procedere. In tutto questo sembrano essere coinvolti dei loci citoplasmatici, detti "corpi P", contenenti proteine coinvolte nel metabolismo dell'RNA messaggero. Tali formazioni sono prive di ribosomi, contengono proteine associate al RISC (Ago1-4, GW182) ed enzimi degrativi che promuovono il processo di deadenilazione (deadenilasi CCR4) e di "decapping" (Dcp1/Dcp2). Un aspetto completamente nuovo emerso recentemente riguarda l'attivazione della traduzione mediata da miRNA. I dati attualmente disponibili sui miRNA mettono chiaramente in luce come in cellule in rapida proliferazione la proteina Ago2 umana, associata al miR369-3, impedisce la traduzione dell’mRNA del tumor necrosis factor. I ricercatori,tuttavia, hanno scoperto che se nelle stesse cellule si verifica l’arresto del ciclo cellulare in G0/G1, a causa della mancanza di siero o dell’inibizione da contatto, miR369-3 si appaia con le basi di una particolare regione del messaggero che codifica per TNF-α la cosiddetta sequenza ARE. In queste condizioni viene così reclutato il complesso FXR1-AGO2 e la conseguenza di ciò provoca l’attivazione della traduzione.

miRNA e implicazioni[modifica | modifica wikitesto]

Studi attuali stanno dimostrando che in alcuni tipi di cancro i livelli di certi miRNA sono bassi: questo potrebbe evidenziare che i miRNA hanno in quei casi, essenzialmente, una funzione di difesa dal cancro. È stato individuato un miRNA, il miR-32, che si pensa medi la difesa antivirale nelle cellule umane. Questo miRNA, riconoscendo in modo fortuito una sequenza complementare all'RNA virale, limiterebbe l'accumulo di un virus schiumoso dei primati nelle cellule umane. È stato infatti dimostrato che bloccando il miR-32 il virus raddoppierebbe la velocità di replicazione nelle cellule umane dando così origine ad una infezione virale. Di recente, contrariamente a quanto affermato, è sorto il sospetto che i microRNA abbiano in realtà un ruolo nella genesi dei tumori: diversi studi dimostrano che nelle cellule tumorali il pattern di espressione genica di certi microRNA è diverso rispetto alle cellule sane corrispondenti e che molte cellule tumorali, altrimenti indistinguibili da quelle sane, siano identificabili confrontando il pattern di attività dei microRNA. È stato inoltre evidenziato che molti miRNA risultano espressi a bassissimi livelli nei tumori rispetto al tessuto sano e quindi lo studio dell’espressione di questi miRNA potrebbe in qualche modo fornire informazioni specifiche per la classificazione di tumori scarsamente differenziati.
I miRNA dunque, potrebbero direttamente indurre il cancro, come dimostrato per la prima volta in alcuni linfomi di modelli animali, tanto da parlare di microRNA-oncogenici. Le prime evidenze di una connessione diretta tra i miRNA e i tumori furono evidenziate con l’osservazione di 2 geni di miRNA, miR-15 e miR-16, localizzati in una regione di 30Kb sul cromosoma 13, che presentavano un'espressione ridotta nella leucemia linfatica cronica (Calin et al., 2002). I miRNA che sembrano coinvolti nello sviluppo tumorale sono chiamati "oncomiRs" (Esquela-Kerscher and Slack, 2006). I miRNA oncogenici includono il miR-155 e il miR-17-5p, i miRNA con attività oncosoppressiva includono il miR-15, mi-16 e il let-7 (Schickel et al., 2008). Oggi, grazie alle nuove tecniche di analisi dell’espressione genica, il numero di miRNA implicati nei tumori umani sta aumentando considerevolmente.
I miRNA sembrano inoltre implicati nella crescita cellulare e nell'apoptosi, nello sviluppo embrionale, nella plasticità e nel rimodellamento neuronale, e addirittura nella secrezione dell'insulina. Un nuovo esempio è miRNA-375: senza questa molecola le cellule beta del pancreas degenerano causando il diabete. Una sovrabbondanza di miRNA è stata rivelata nei casi di ritardo mentale dovuto a X fragile.

MiRNA e patologie[modifica | modifica wikitesto]

Così come il miRNA è coinvolto nel normale funzionamento delle cellule eucariote, una disregolazione dei meccanismi che coinvolgono i miRNA possono essere associati alle malattie.

miRNA ed il cancro
Sono stati trovati diversi miRNA coinvolti con alcuni tipi di cancro. Il miR-21 è uno dei primi microRNA che sono stati identificati come oncomiR (miRNA associati al cancro poiché, ad esempio, sono stati trovati nella linea cellulare tumorale o in un tumore primario). Uno studio su dei topi modificati nel produrre un eccesso di c-Myc (proteina le cui forme mutate sono associate al cancro) mostra come i miRNA hanno un effetto sullo sviluppo del cancro. I topi ingegnerizzati per produrre un surplus di tipi di miRNA nelle cellule di linfoma, hanno sviluppato la malattia entro 50 giorni ed sono morti due settimane dopo. Invece, i topi senza surplus di miRNA sono vissuti per più di 100 giorni. È stato identificato un altro miRNA, il miR-183, che interagisce con la regione di codificazione dell'mRNA di BtrCP1 (beta-trasducin repeat containing protein 1). BtrCP1 è un gene umano (omologo nello Xenopus, Danio rerio, Drosophyla e nei lieviti) veramente instabile; la degradazione dell'mRNA di BtrCP1 da parte del miR-183 potrebbe portare allo sviluppo del cancro colon-rettale e di altri tumori. Il frammento che va dal nucleotide 577 al 1182 dell'mRNA di BtrCp1, contiene siti di legame per i miRNA. È stato dimostrato che la proteina CRD-PB protegge tale regione di codificazione dell'mRNA di BtrCP1 dalla degradazione miR-183 dipendente, aumentando così l'emivita dell'mRNA, inducendo la soppressione e l'apoptosi delle cellule cancerose; più precisamente, la proteina CRD-PB (conosciuta anche come IMP-1) inibisce l'interazione tra l'mRNA di BtrCP1, Ago2 ed altri membri del RISC. Qualora il miR-183 non venisse bloccato, dirigerebbe il RISC verso la regione codificante dell'mRNA di BtrCP1 degradandolo (V. Spiegelman, 2009).

miRNA e malattia cardiaca
Il ruolo della funzione del miRNA nel cuore è stato affrontato inibendo la maturazione del miRNA nel cuore di topo e ha rivelato che i microRNA svolgono un ruolo essenziale durante il suo sviluppo. Studi del profilo di espressione del miRNA hanno dimostrato che il livello di espressione di specifici miRNA cambia in malati di cuore umani, puntando al loro coinvolgimento in cardiomiopatie. Inoltre, studi su specifici miRNA in modelli animali, hanno identificato ruoli distinti dei miRNA, sia durante lo sviluppo normale del cuore e in condizioni patologiche, tra cui la regolazione di fattori chiave importanti per la cardiogenesi, la risposta di crescita ipertrofica e la conduttanza cardiaca.

miRNA ed il sistema nervoso
I miRNA sembrano regolare il sistema nervoso. MiRNA neurali sono coinvolti in vari stadi di sviluppo sinaptico, tra cui la formazione dei dendriti (che coinvolge miR-132 e miR-124), la formazione della sinapsi e la maturazione della sinapsi stessa (dove si ritiene che siano coinvolti miR-134 e miR-138). Alcuni studi hanno individuato un’espressione alterata dei miRNA nella schizofrenia.

miRNA e diabete
Recenti studi hanno scoperto che miR-375 è essenziale per la sopravvivenza, la crescita e la divisione delle cellule beta del pancreas. Una mancanza di miRNA-375 induce le cellule beta a morire, mentre le cellule che producono il glucagone - le cellule alfa - aumentano di massa. Gli scienziati hanno anche scoperto un legame tra questa catena di RNA ed il diabete di tipo 2. Le cellule beta di topi obesi contengono più miR-375 rispetto a topi normali. Quando i ricercatori hanno rimosso il gene che codifica per miR-375, gli animali obesi hanno sviluppato il diabete. La spiegazione di questo fenomeno è che le cellule beta di animali obesi possono moltiplicarsi ed espandersi, quindi produrre più insulina al fine di superare la resistenza dei muscoli, grasso e fegato all'ormone. La massa delle cellule beta può aumentare fino a cinque volte. Come risultato, i livelli di glucosio nel sangue rimangono normali durante questa fase grazie ad una iper-produzione di insulina. Tuttavia, se miR-375 non è presente, il collasso delle cellule beta che porta ad una riduzione della massa di quest’ultime, che non sono più in grado di compensare il difetto di azione dell'insulina. Una delle ragioni di questo sviluppo è che miR-375, un regolatore di numerosi fattori di crescita in cellule beta, limita il processo di proliferazione delle cellule beta pancreatiche. Senza miR-375, il numero di cellule beta si riduce nel tempo. Il risultato è una mancanza di insulina, che a sua volta conduce al diabete.


Voci correlate[modifica | modifica wikitesto]

Bibliografia[modifica | modifica wikitesto]

(*) Bartel, D.P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297
(*) Shyu, AB et All. (2008). Messenger RNA regulation: to translate or to degrade. Embo J. 27, 471-481t
(*) NCBI, Biosystem, MicroRNA (miRNA) biogenesis, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosystems/106335

Biologia Portale Biologia: accedi alle voci di Wikipedia che trattano di Biologia