Southern blot
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La Southern Blot è una tecnica usata per rivelare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela complessa. Prende il nome dal suo inventore, Edwin Mellor Southern.
Un campione eterogeneo di dna genomico viene trattato con enzimi di restrizione e successivamente sottoposto ad elettroforesi su gel d'agarosio o di poliacrilammide. Nel gel osservero uno smear, ossia una striscia continua; non si vedranno bande nette perchè il DNA genomico digerito con l'enzima di restrizione ha tantissimi punti di taglio, e quindi avrò sul gel tantissimi frammenti con PM diversi che migreranno con velocità diverse. Il gel viene quindi immerso in una soluzione alcalina (per denaturare il DNA), solitamente si tratta di una soluzione molto diluita di NAOH per 15 minuti. Succesivamente viene coperto da un foglio di nitrocellulosa e sopra di questo viene posta una pila di fogli assorbenti. Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nitrocellulosa e risalirà nei fogli assorbenti. I sali trascinano i segmenti di DNA perfettamente in verticale, depositandoli sullo strato di nitrocellulosa con il quale i segmenti instaurano legami elettrostatici. Da notare che in questo passaggio il dna non sale grazie a una forza elettrica come nella prima elettroforesi ma solo per capillarità.
A questo punto il foglio viene separato dal gel e immerso in una soluzione contenenente una sonda marcata in vario modo (fluorescenza, radioattività, ecc..) che ibridizza con sequenze di DNA complementari presenti sul foglio, identificandole. La sonda viene creata con tecniche di amplificazione del DNA. L'ibridizzazione della sonda con il DNA può avvenire con diversi gradi di "stringenza" a seconda delle finalità dell'esperimento, consentendo una ibridizzazione con specificità anche inferiore al 100%. A seguito di lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica che metta in evidenza dove la sonda ha legato il dna genomico.
