Southern blot

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Il Southern Blot è una tecnica usata in biologia molecolare per rivelare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela complessa. Prende il nome dal suo inventore, Edwin Mellor Southern.

Procedura[modifica | modifica sorgente]

  • Un campione eterogeneo di DNA genomico viene trattato con enzimi di restrizione e successivamente sottoposto ad elettroforesi su gel d'agarosio o di poliacrilammide. Nel gel sarà possibile osservare uno smear, ossia una striscia continua; non si vedranno bande nette perché il DNA genomico digerito con l'enzima di restrizione ha tantissimi punti di taglio, quindi sul gel si troveranno tantissimi frammenti che migreranno con velocità diverse in base al diverso peso molecolare.
  • Il gel viene immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA; solitamente si tratta di una soluzione molto diluita di NaOH per un tempo pari a 15 minuti.
  • Il gel viene coperto da un foglio di nitrocellulosa o nylon a carica positiva e sopra di questo viene posta una pila di fogli assorbenti. Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nitrocellulosa e risalirà nei fogli assorbenti. I sali trascinano i segmenti di DNA perfettamente in verticale, depositandoli sullo strato di nitrocellulosa con il quale i segmenti instaurano legami elettrostatici (dovute alle cariche negative dei gruppi fosfato del DNA che si legano alle positive della membrana). Da notare che in questo passaggio il DNA non sale grazie a una forza elettrica come nella prima elettroforesi ma solo per capillarità.
  • Il foglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e vengono saturate le cariche positive con DNA eterologo (solitamente DNA da salmone); processo di preibridizzazione.
  • Il foglio di nitrocellulosa viene quindi immerso in una soluzione contenente una sonda marcata in vario modo (fluorescenza, radioattività, ecc..) che ibridizza con sequenze di DNA complementari presenti sul foglio, identificandole. La sonda viene creata con tecniche di amplificazione del DNA. L'ibridizzazione della sonda con il DNA può avvenire con diversi gradi di "stringenza" a seconda delle finalità dell'esperimento, consentendo una ibridizzazione con specificità anche inferiore al 100%.
  • A seguito di lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica che metta in evidenza dove la sonda ha legato il DNA genomico.[1]

Tecniche affini[modifica | modifica sorgente]

Successivamente all'invenzione del Southern blot vennero elaborate altre tecniche simili, che per una sorta di scherzo tra scienziati, vennero designate con aggettivi riferiti ai punti cardinali, in analogia con il Southern blot, che trae però il nome dall'inventore: Edwin Mellor Southern.

Note[modifica | modifica sorgente]

  1. ^ Southern, E.M. (1975): "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis", J Mol Biol., 98:503-517. PMID 1195397

Voci correlate[modifica | modifica sorgente]

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