Cromatografia

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Un apparato per FPLC (fast protein liquid chromatography) esposto al Science Museum di Londra

La cromatografia (dal greco χρῶμα, traslitterato in kroma, "colore"), è una tecnica di separazione delle componenti di un miscuglio omogeneo basata sulla distribuzione dei suoi componenti tra due fasi, una stazionaria e una in movimento lungo una direzione definita.[1].

Storia[modifica | modifica wikitesto]

L'invenzione della cromatografia viene attribuita al biochimico italo-russo Michail Cvet (pronunciato e a volte trascritto Tswett) nel 1906, quando riuscì, con questa tecnica, a separare la clorofilla da un estratto vegetale.[2] Cvet procedette ponendo una piccola quantità di estratto di foglie verdi alla sommità di una colonna di vetro riempita con particelle di argilla e lavando successivamente il campione. Fece poi colare, attraverso la colonna, dell'etere di petrolio. A mano a mano che l'etere di petrolio fluiva trascinando con sé il campione, questo si separava in bande di diverso colore (da qui il nome "cromatografia"), ciascuna delle quali procedeva verso il fondo della colonna con diversa velocità.

Con il suddetto esperimento Cvet mise in evidenza la possibilità di impiegare questo sistema di frazionamento, creando le basi della moderna cromatografia. Il termine si richiama alla separazione di bande di diverso colore e viene ancor oggi utilizzato anche se raramente la separazione si basa sulla differenza cromatica. Questa tecnica è oggi infatti applicata all'analisi di sostanze anche incolori, utilizzando il trasferimento tra le fasi con procedimenti più elaborati ed apparecchiature che possono avere notevole complessità.

Con il termine cromatografia oggi si indicano in genere tutte le varie tecniche separative, applicabili a miscele di sostanze e basate sulla distribuzione fra due fasi in cui si utilizza uno stesso principio, la diversa velocità con cui i differenti componenti di una miscela migrano in una fase stazionaria sotto l'influenza di una fase mobile, che ha il compito di trascinare lungo il sistema i soluti che costituiscono la miscela in esame.

Cromatogramma[modifica | modifica wikitesto]

Esempio di cromatogramma, mostrante 2 picchi separati

Quando il rivelatore posto in fondo all'apparecchio registra il passaggio di una sostanza eluita, elabora i dati su di un "cromatogramma", un grafico che rappresenta la quantità di sostanza rilevata in funzione del tempo. Ogni volta che una sostanza viene rivelata, il cromatogramma registra un picco più o meno alto a seconda della sua concentrazione. Perché un cromatogramma possa essere ritenuto accettabile, deve avere una buona risoluzione. Per risoluzione si intende un parametro che mette in relazione l'efficienza, la selettività ed il fattore di ritenzione. Oltre che considerazioni quantitative, dal cromatogramma si possono trarre anche considerazioni qualitative in base ai diversi tempi in cui compaiono i picchi.

Grandezze fondamentali[modifica | modifica wikitesto]

  • Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall’inizio all’uscita della colonna.
  • Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile.
  • Fattore di capacità (k'): è un parametro che mette in relazione il tempo di ritenzione di un analita col tempo morto.
k'=\frac{t_R-t_M}{t_M}

La differenza tra tempo di ritenzione e tempo morto, ed il tempo morto stesso sono direttamente ricavabili dal cromatogramma.

  • Selettività (α): per avere una buona selettività i picchi del cromatogramma devono essere il più distanti possibili, ovvero sostanze di specie diversa devono avere tempi di ritenzione diversi. È possibile migliorare la selettività diminuendo la temperatura di lavoro. Da un punto di vista matematico, la selettività è definita come il rapporto tra i fattori di capacità di due diverse sostanze (a e b) dello stesso cromatogramma, con k’A < k’B quindi:
\alpha=\frac{k'_b}{k'_a}=\frac{t_{Rb}-t_M}{t_{Ra}-t_M}

Quanto più la selettività è maggiore di 1, tanto migliore sarà la separazione cromatografica.

  • Efficienza: avere una buona selettività non basta. Infatti, anche se i picchi sono ben distanziati, è possibile che siano talmente larghi che si sovrappongono fra loro. Per questo è necessario che particelle di una stessa specie vengano eluite con la stessa velocità, di modo che la banda all'interno della colonna cromatografica sia il più stretta possibile.

L'efficienza di un sistema cromatografico e in particolare di una colonna, si quantifica con il cosiddetto numero di piatti teorici (N). Un piatto teorico è la più piccola zona adiacente all'interno della colonna in cui il soluto raggiunge un equilibrio tra fase mobile e stazionaria; sostanzialmente un piatto teorico è la più piccola fetta della colonna in cui due molecole dotate di diverso coefficiente di ripartizione hanno la possibilità di dimostrare diverse velocità di migrazione. Migliore una colonna, minore è l’altezza del piatto teorico (lo ‘spessore’ della fetta).

Tipi di cromatografia[modifica | modifica wikitesto]

Apparecchiatura complessa per la gascromatografia

Dal primo esperimento di Cvet la tecnica si è estremamente evoluta. Oggi esistono vari tipi di cromatografie, generalmente classificate in funzione della natura delle fasi stazionaria e mobile. La seguente tabella ne riassume alcune

tipo fase stazionaria fase mobile
gascromatografia (GC) solida o liquida supportata su solido gas
cromatografia liquida (LC) solida o liquida supportata su solido liquida
cromatografia su strato sottile (TLC)[3] solida liquida
cromatografia a scambio ionico (IEC) solida liquida
Cromatografia di esclusione molecolare (EC) solida liquida

All'interno delle precedenti categorie si possono avere ulteriori suddivisioni. In particolare la cromatografia liquida si suddivide in cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e cromatografia liquida classica (utilizzata a scopo preparativo); inoltre vi è un'ulteriore suddivisione basata sul meccanismo di separazione: si distinguono infatti la cromatografia di affinità, di adsorbimento, ionica, nonché la cromatografia a permeazione di gel (impiegata nella separazione dei polimeri in funzione del loro peso molecolare).

L'utilizzo di fasi stazionarie chirali consente anche la separazione di miscele racemiche in enantiomeri puri.

Note[modifica | modifica wikitesto]

  1. ^ (EN) IUPAC Gold Book, "chromatography". URL consultato il 7 agosto 2014.
  2. ^ D.W. Gruenwedel, J.R. Whitaker, Food analysis: principles and techniques, Volume 4, New York, Marcel Dekker Inc., 1987, ISBN 0-8247-7573-2.
  3. ^ da thin layer chromatography, usata in laboratorio di sintesi per seguire l'andamento delle reazioni

Bibliografia[modifica | modifica wikitesto]

  • (EN) Warren McCabe, Julian Smith, Peter Harriott, Unit Operations In Chemical Engineering, 6ª ed., Tata Mcgraw Hill Publishers, 2005, pp. 845-852, ISBN 0-07-060082-1.
  • E. Mentasti, G. Saini, Analisi Chimica Cromatografica, Padova, Piccin Nuova Libraria, 1990, ISBN 88-299-0862-2.
  • R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Analisi Chimica Moderni Metodi Strumentali, Teoria - Strumentazione 1992, Zanichelli, ISBN 88-08-15910-8.

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