MicroRNA

Struttura RNA

Definizione

I miRNA sono piccole molecole di RNA endogene, a singolo filamento di 20-22 nucleotidi che svolgono diverse funzioni, la più nota attualmente è una regolazione post-trascrizionale. Nei vertebrati i miRNA costituiscono circa l’1% di tutti i geni. Essi rappresentano una classe di small RNAs unitamente agli Short interfering RNA (siRNA), MicroRNA (miRNA), Piwi RNA (piRNA), Trans-acting siRNA (tasiRNA), Small-scan RNA (scnRNA) e Repeat-associated siRNA (rasiRNA). Le prime due molecole sono ampiamente presenti in natura e derivano da precursori a doppio filamento, i PiwiRna sono molto presenti negli animali e sembrano derivare da precursori a singolo filamento, anche se per questi si hanno poche informazioni. I microRNA sono, per la maggior parte, ampiamente caratterizzati nelle piante e nei nematodi (dove per la prima volta vennero osservati). I miRNA provengono da precursori più grandi, rispetto ai loro 20-22 nucleotidi, trascritti da geni non codificanti proteine. Questi trascritti contengono sequenze che formano strutture a forcina che vengono processate dalle Dicer (o nelle piante DCL1, proteina simile a Dicer). I miRNA portano alla distruzione (in genere nelle piante) o alla repressione della traduzione (nei vermi) di quegli mRNA bersaglio che hanno un certo grado di omologia con i miRNA.

Breve storia sulle origini

Sono stati scoperti all'inizio degli anni novanta del secolo scorso, nel nematode C.elegans, da Victor Ambros durante lo studio di mutazioni che determinavano cambiamenti nella tempistica dello sviluppo del verme. Nel corso di questi studi è stato infatti individuato un gene “lin-4” che codificava per due piccoli RNA: uno di circa 22 nucleotidi e l’altro di 61 nucleotidi. Quest’ultimo rappresenta il precursore del più corto. Inoltre lin-4 mostrava una complementarietà antisenso per diversi siti a livello della regione 3’UTR del gene lin-14. Lin-4 in sostanza regolava Lin-14, riducendo la quantità di proteina prodotta senza modificare i livelli di messaggero (V. Ambros, 1993). Da allora, l’RNA Lin-4 di 22 nucleotidi è stato riconosciuto come capostipite di un’ampia classe di RNA regolatori chiamata “microRNA” o “miRNA”. Nel 2000, è stato individuato nel C.elegans un altro gene "let-7", codificante per un secondo miRNA di circa 22 nucleotidi, coinvolto nella transizione dallo stato larvale a quello adulto; omologhi del gene let-7 vennero inseguito scoperti anche nell'uomo e nelle mosche.Solo un anno dopo, vennero identificati oltre 100 miRNA, dei quali 20 in Drosophila, 30 nell'uomo e 60 nei vermi. -

Biogenesi dei miRNA

• I siRNA possono derivare da trascritti di dsRna come: Rna virali, Rna hairpin, trasposoni, centromeri, trascritti antisenso più trascritti senso di geni affini.
• I miRNA derivano da trascritti di sequenze specifiche, i quali si presentano come sequenze di dsRNA con struttura secondaria (stem-loop) chiamate pri-miRNA, generati dalla trascrizione di alcuni geni ad opera del RNA polimerasi II.I pri-miRNA sono molecole grandi anche migliaia di nucleotidi che subiscono poliadenilazione, capping e presumibilmente splicing degli introni; vengono poi processati da apposite RNAsi di tipo III chiamate Drosha (negli animali e Dcl1 nelle piante) e Pasha, generando in questo modo molecole lunghe 70-80 nucleotidi con struttura a forcina ed estremità 3' protrudenti di due nucleotidi, definite pre-miRNA.

I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma grazie all'esportina 5 (proteina localizzata sulla membrana nucleare), che media la loro traslocazione nel citoplasma per la recisione dell'ansa (Bartel, 2004) e quindi per la maturazione, attraverso un meccanismo Ran-GTP mediato. Nelle piante invece i due tagli avvengono entrambi nel nucleo. Nel citoplasma i pre-miRNA subiscono un riarrangiamento ulteriore ad opera di un particolare dominio della proteina dicer (endonucleasi RNasi III), denominato "Paz" (il quale riconosce le estremità 3'derivanti dal processamento di Drosha),creando così molecole a singolo filamento lunghe circa 21 nucleotidi: i miRNA.
Tale enzima risulta composto oltre che da "Paz" anche da altri domini come quello ATPasico/elicasico e DUF283, le cui funzioni non sono state ancora definite, mentre il centro catalitico di Dicer è formato da RIIIa e RIIIb, domini che tagliano il dsDNA, a 20bp dall'estremità libera. Alcuni miRNA vanno incontro ad un processamento Drosha indipendente (Bartel, 2007) o Dicer indipendente (Lai, 2010). Ciascun miRNA si lega al complesso proteico RISC e lo guida verso l'mRNA target.
Il RISC è il “Complesso di Silenziamento Indotto da Rna” il cui centro catalitico è rappresentato dalle proteine Argonauta. Si tratta di proteine di circa 100 kDa, chiamate anche proteine "PPD" perché costituite dai domini PAZ e PIWI. Nell'uomo possiamo trovarne almeno quattro Ago1-4, caratterizzate da ripetizioni ricche in glutammina all'estremità N-terminale; tra queste la più importante negli Eucarioti è Ago 2. E’ possibile che le proteine Argonauta competano con il fattore eIF4E per legare il cap, evitando così la formazione del complesso eIF4F sul cap al 5’, necessario per l’inizio della traduzione cap-dipendente (Hoff, 2008). Si è visto che un mRNA può essere riconosciuto e legato da diversi complessi miRNA-RISC, inoltre ciascun tipo di complesso miRNA-RISC può legarsi ad mRNA target diversi.
Nelle piante, si è visto che il complesso costituito da RISC e miRNA si associa per complementarietà perfetta alla CDS degli mRNA target causando il taglio dell'mRNA.
Negli animali invece, si è visto che il complesso costituito da RISC e miRNA si associa per complementarietà imperfetta alla 3'UTR dell'mRNA target, causando in questo modo il blocco della traduzione di quell'mRNA come conseguenza ad uno svolgimento impossibile dello stesso da parte di elicasi associate al ribosoma e alla sua catalisi.

Funzioni

Inizialmente si pensava che i miRNA potessero diminuire l’espressione delle proteine, soltanto attraverso l’inibizione della traduzione dell'mRNA target. Recenti studi hanno invece indicato che tanti miRNA possono indurre una rapida degradazione degli mRNA target, riducendo indirettamente la quantità di proteina prodotta. Sono stati individuati almeno due modi generali di down-regulation, mediati dai miRNA nelle cellule dei Metazoi: la repressione della traduzione e la degradazione dell’RNA messaggero.Il meccanismo della repressione traduzionale mediato dai miRNA è ancora una questione controversa. Si ipotizza che i miRNA inibiscano l’inizio della traduzione, oppure una fase di “post-inizio” nella sintesi proteica, determinando la degradazione co-traduzionale del peptide nascente. Come accennato precedentemente, in alcuni casi i miRNA possono provocare la degradazione dell’mRNA attraverso la deadenilazione. Un quadro generale del decadimento dell’RNA mediato dal miRNA (NMD, "Nonsense-mediated decay") sembra emergere da recenti studi su cellule di D. melanogaster, embrioni dello zebrafish, Saccaromyces cerevisiae e cellule umane, nelle quali gli mRNA legati dai miRNA subiscono una precedente deadenilazione prima di essere degradati. Nello zebrafish, il miRNA miR-430 conduce diverse centinaia di mRNA materni al decadimento tramite una rapida deadenilazione: questa distruzione massiva degli mRNA materni è necessaria per silenziare l’espressione dell’mRNA materno in modo che lo sviluppo dell’embrione dello zebrafish possa procedere. In tutto questo sembrano essere coinvolti dei loci citoplasmatici, detti "corpi P", contenenti proteine coinvolte nel metabolismo dell'Rna messaggero. Tali formazioni sono prive di ribosomi, contengono proteine associate al RISC (Ago1-4, GW182) ed enzimi degrativi che promuovono il processo di deadenilazione (deadenilasi CCR4) e di "decapping" (Dcp1/Dcp2).

miRNA e implicazioni

Studi attuali stanno dimostrando che in alcuni tipi di cancro i livelli di certi miRNA sono bassi: questo potrebbe evidenziare che i miRNA hanno in quei casi, essenzialmente, una funzione di difesa dal cancro. E' stato individuato un miRNA, il miR-32, che si pensa medi la difesa antivirale nelle cellule umane. Questo miRNA, riconoscendo in modo fortutito una sequenza complementare all'RNA virale, limiterebbe l'accumulo di un virus schiumoso dei primati nelle cellule umane. E' stato infatti dimostrato che bloccando il miR-32 il virus raddoppierebbe la velocità di replicazione nelle cellule umane dando così origine ad una infezione virale. Di recente, contrariamente a quanto affermato, è sorto il sospetto che i microRNA abbiano in realtà un ruolo nella genesi dei tumori: diversi studi dimostrano che nelle cellule tumorali il pattern di espressione genica di certi microRNA è diverso rispetto alle cellule sane corrispondenti e che molte cellule tumorali, altrimenti indistinguibili da quelle sane, siano identificabili confrontando il pattern di attività dei microRNA. È stato inoltre evidenziato che molti miRNA risultano espressi a bassissimi livelli nei tumori rispetto al tessuto sano e quindi lo studio dell’espressione di questi miRNA potrebbe in qualche modo fornire informazioni specifiche per la classificazione di tumori scarsamente differenziati. I miRNA dunque, potrebbero direttamente indurre il cancro, come dimostrato per la prima volta in alcuni linfomi di modelli animali, tanto da parlare di microRNA-oncogenici. Le prime evidenze di una connessione diretta tra i miRNA e i tumori furono evidenziate con l’osservazione di 2 geni di miRNA, miR-15 e miR-16, localizzati in una regione di 30Kb sul cromosoma 13, che presentavano un'espressione ridotta nella leucemia linfatica cronica (Calin et al., 2002).I miRNA che sembrano coinvolti nello sviluppo tumorale sono chiamati "oncomiRs" (Esquela-Kerscher and Slack, 2006). I miRNA oncogenici includono il miR-155 e il miR- 17-5p, i miRNA con attività oncosoppressiva includono il miR-15, mi-16 e il let-7 (Schickel et al., 2008). Oggi, grazie alle nuove tecniche di analisi dell’espressione genica, il numero di miRNA implicati nei tumori umani sta aumentando considerevolmente. I miRNA sembrano inoltre implicati nella crescita cellulare e nell'apoptosi, nello sviluppo embrionale, nella plasticità e nel rimodellamento neuronale, e addirittura nella secrezione dell'insulina,un nuovo esempio è miRNA-375.Senza questa molecola le cellule beta del pancreas degenerano causando il diabete. Una sovrabbondanza di miRNA è stata rivelata nei casi di ritardo mentale dovuto a X fragile.

MiRNA e la malattia

Così come il miRNA è coinvolto nel normale funzionamento delle cellule eucariote, una disregolazione del miRNA è stata associata alla malattia.

miRNA E IL CANCRO
Sono stati trovati diversi miRNA coinvolti con alcuni tipi di cancro. Il MicroRNA-21 è uno dei primi microRNA che sono stati identificati come oncomiR (miRNA associati al cancro poiché, ad esempio, sono stati trovati nella linea cellulare tumorale o in un tumore primario). Uno studio su dei topi modificati nel produrre un eccesso di c-Myc (proteina le cui forme mutate sono associate al cancro) mostra come i miRNA hanno un effetto sullo sviluppo del cancro. I topi ingegnerizzati nel produrre un surplus di tipi di miRNA. I topi che sono stati progettati per produrre un surplus di tipi di miRNA nelle cellule di linfoma, hanno sviluppato la malattia entro 50 giorni ed sono morti due settimane dopo. Invece, i topi senza surplus di miRNA sono vissuti per più di 100 giorni. E' stato identificato un altro miRNA, il miR-183, che interagisce con la regione di codificazione dell'mRNA di BtrCP1 (beta-trasducin repeat containing protein 1). BtrCP1 è un gene umano (omologo nello Xenopus, Zebrafish, Drosophyla e nel lievito) veramente instabile; la degradazione delll'mRNA di BtrCP1 da parte del miR-183 potrebbe portare allo sviluppo del cancro colon-rettale e di altri tumori. Il frammento che va dal nucleotide 577 al 1182 dell'mRNA di BtrCp1, contiene siti di legame per i miRNA. E' stato dimostrato che la proteina CRD-PB protegge tale regione di codificazione dell'mRNA di BtrCP1 dalla degradazione miR-183 dipendente, aumentando così l'emivita dell'mRNA, inducendo la soppressione e l'apoptosi delle cellule cancerose; più precisamente, la proteina CRD-PB (conosciuta anche come IMP-1) inibisce l'interazione tra l'mRNA di BtrCP1, Ago2 ed altri membri del RISC. Qualora il miR-183 non venisse bloccato, dirigerebbe il RISC verso la regione codificante dell'mRNA di BtrCP1 degradandolo (V. Spiegelman, 2009).

miRNA E MALATTIA CARDIACA
Il ruolo della funzione del miRNA nel cuore, è stato affrontato inibendo la maturazione del miRNA nel cuore di topo e ha rivelato che i microRNA svolgono un ruolo essenziale durante il suo sviluppo. Studi del profilo di espressione del miRNA hanno dimostrato che il livello di espressione di specifici miRNA cambia in malati di cuore umani, puntando al loro coinvolgimento in cardiomiopatie. Inoltre, studi su specifici miRNA in modelli animali, hanno identificato ruoli distinti dei miRNA, sia durante lo sviluppo del cuore e in condizioni patologiche, tra cui la regolazione di fattori chiave importanti per la cardiogenesi, la risposta di crescita ipertrofica e la conduttanza cardiaca.

miRNA E IL SISTEMA NERVOSO
I miRNA sembrano regolare il sistema nervoso. MiRNA neurali sono coinvolti in vari stadi di sviluppo sinaptico, tra cui la formazione dei dendriti (che coinvolge miR-132, miR-124), la formazione della sinapsi e la maturazione della sinapsi stessa (dove si ritiene cjìhe siano coinvolti miR-134 e miR-138). Alcuni studi hanno individuato un’ espressione alterata dei miRNA nella schizofrenia.

L’IMPORTANZA DI miRNA-375
Le cellule beta svolgono un ruolo importante nel diabete. Esse producono insulina, un ormone che riduce il livello di zucchero nel sangue dopo aver mangiato. Senza insulina, i livelli ematici di glucosio aumentano. Quando il corpo è a digiuno, il glucagone, un ormone che svolge il ruolo opposto a quello dell’insulina, fa sì che il fegato converta le sue riserve di glucosio e rilasci queste nel sangue. Ciò può portare a livelli di glucosio in eccesso nel sangue. Recenti studi hanno scoperto che miR-375 è essenziale per la sopravvivenza, la crescita e la divisione delle cellule beta. Una mancanza di miRNA-375 induce le cellule beta a morire, mentre i produttori del glucagone - le cellule alfa - aumentano di massa. Gli scienziati hanno anche scoperto un legame tra questa catena di RNA e diabete di tipo 2. Le cellule beta di topi obesi contengono più miR-375 rispetto a topi normali. Quando i ricercatori hanno rimosso il gene che codifica per miR-375, gli animali obesi hanno sviluppato il diabete, perché il loro fegato produce glucosio pompato nel sangue in modo incontrollato e i muscoli e le cellule di grasso sono in grado di assorbire il glucosio. La spiegazione di questo fenomeno è che le cellule beta di animali obesi possono moltiplicarsi ed espandersi, quindi produrre più insulina al fine di superare la resistenza dei muscoli, grasso e fegato. La massa delle cellule beta può aumentare fino a cinque volte. Come risultato, i livelli di glucosio nel sangue rimangono normali durante questa fase. Tuttavia, se miR-375 non è presente, il collasso delle cellule beta che porta ad una riduzione della massa di quest’ultime, non è più in grado di compensare il difetto di azione dell'insulina. Una delle ragioni di questo sviluppo è che miR-375, un regolatore di numerosi fattori di crescita in cellule beta, limita il processo di proliferazione delle cellule beta pancreatiche. Senza miR-375, il numero di cellule beta si riduce nel tempo. Il risultato è una mancanza di insulina, che a sua volta conduce al diabete

Voci correlate

• Dicer
• RNA interference
• shRNA
• siRNA

Bibliografia

(*) Bartel, D.P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297 (*) Shyu, AB et All. (2008). Messenger RNA regulation: to translate or to degrade. Embo J. 27, 471-481t

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