Ibridazione fluorescente in situ

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Una cellula in metafase positive alla riorganizzazione del bcr/abl utilizzando la FISH

La ibridazione fluorescente in situ, in inglese Fluorescent in situ hybridization (FISH) è una tecnica citogenetica che può essere utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l'assenza di specifiche sequenze di DNA nei cromosomi. Essa utilizza delle sonde a fluorescenza che si legano in modo estremamente selettivo ad alcune specifiche regioni del cromosoma. Per individuare il sito di legame tra sonda e cromosoma si utilizzano tecniche di microscopia a fluorescenza.

Processo[modifica | modifica wikitesto]

Innanzi tutto bisogna preparare la sonda, che deve essere abbastanza lunga per ibridare esattamente il suo obiettivo (e non un'altra sequenza simile del genoma), ma non deve essere troppo grande da impedire il processo e potrebbe essere marcata con metodi diretti o indiretti: sono da preferire i metodi indiretti in cui il segnale è determinato, non direttamente da un fluorocromo legato ad un nucleotide della sonda, ma dall'interazione di biotina o digossigenina legate ad un nucleotide sempre della sonda, con substrati (avidina/streptavidina o anticorpi anti-digossigenina)legati direttamente ad un fluorocromo. Questo metodo permetterà la visualizzazione di un segnale migliore e più intenso, rispetto ad una marcatura diretta del nucleotide della sonda. Essa può essere fatta in vari modi, per esempio con la nick translation e la reazione a catena della polimerasi usando dei nucleotidi marcati.

Poi, si produce un preparato cromosomico. I cromosomi sono attaccati saldamente al substrato-, di solito di vetro. Dopo la preparazione si applica la sonda al DNA del cromosoma e si inizia l'ibridazione. In molti passaggi di lavaggio tutte le sonde non ibridate o parzialmente ibridate vengono rimosse.

Se l'amplificazione del segnale è necessaria a superare il limite della sensibilità del microscopio (che dipende da molti fattori come l'efficienza della sonda, il tipo di sonda e la tinta fluorescente), gli anticorpi fluorescenti o la streptavidina si legano alle molecole marcate, per amplificarne la fluorescenza.

Infine, il campione è poi messo in un composto non-imbiancante e osservato al microscopio a fluorescenza.

Interfase FISH[modifica | modifica wikitesto]

FISH (technique).gif

Nell'interfase FISH la sonda è applicata a preparati con nuclei, anche a citospin, sezioni paraffiniche, o anche a nuclei estratti da blocchi paraffinici. L'ibridazione è svolta in modo simile. I segnali fluorescenti sono visti come punti nel nucleo cellulare, che è di solito colorato con una tinta di contrasto che riconosce il DNA.

Fibra FISH[modifica | modifica wikitesto]

Nel fibra FISH, i cromosomi di interfase sono attaccati ad un vetrino in modo tale che siano allungati in linea retta, invece che arrotolati come sono di solito, o adottando una conformazione casuale, come nell'interfase FISH. Si fa ciò utilizzando delle cesoie meccaniche lungo il vetrino o alle cellule che sono state fissate al vetrino e poi tagliate, o ad una soluzione di DNA purificato. Lo srotolamento dei cromosomi permette una risoluzione molto più elevata. La preparazione dei campioni di fibra FISH, anche se concettualmente è semplice, in realtà è talmente complesso da essere definita quasi un'arte, e ciò significa che essi vengono preparati abitualmente solo in laboratori specializzati.

Applicazioni[modifica | modifica wikitesto]

Individuazione attraverso una FISH della traslocazione t9:22 che genera la proteina bcr-abl, causa della leucemia mieloide cronica

La FISH può essere utilizzata per mappare la sequenze di uno specifico cromosoma. Anche se ci sono altri modi per far ciò, il vantaggio principale della FISH è che essa non dipende dalla ricombinazione e così può essere utilizzata nelle regioni cromosomiche dove è soppressa, come nel centromero. Essa può essere utilizzata per mappare le sequenze ripetitive che si presentano in diversi punti del cromosoma.

La FISH può essere utilizzata anche per colorare i cromosomi per raffrontare due specie o varietà utilizzando il DNA di interi cromosomi o addirittura anche l'intero genoma di una specie o di una varietà come sonda nel studiare un'altra specie o varietà. In questo modo, le anormalità dei cromosomi possono essere identificate e si può così dedurre le relazioni evolutive.

La FISH può essere utilizzata per identificare microorganismi ed è ampiamente utilizzata nel campo della microecologia. I Biofilm sono (spesso), per esempio, complesse organizzazioni batteriche multispecie. Preparare le sonde per una specie e utilizzare la FISH con questa sonda permette di visualizzare la distribuzione di questa specie specifica nel biofilm. Preparando la sonda (in due colori diversi) per due specie permette di osservare e studiare la collocazione di queste due specie all'interno del biofilm, rivelando la fine architettura del biofilm.

La FISH si applica anche in studi clinici per scoprire se un paziente è stato infettato da un agente patogeno, i batteri presi dai tessuti o dai fluidi del paziente si sviluppano di solito sull'agar agar (un polisaccaride) per determinare l'identità dell'agente patogeno. Tuttavia molti batteri, anche quelli noti da tempo, non crescono molto bene in laboratorio. La FISH può essere utilizzata per definire direttamente la presenza dell'agente patogeno sui campioni del tessuto del paziente.

Le sonde batteriche della FISH sono spesso iniettori per la regione dell'rRNA 16s.

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