Colorazione di Gram
La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che dà ragione della classificazione dei batteri in Gram-positivi e Gram-negativi (anche indicati come Gram+ e Gram-).
Fu messa a punto nel 1884 dal medico danese Hans Joachim Christian Gram, e mette in evidenza alcune proprietà fondamentali della parete cellulare dei microrganismi.
Con tale metodo è possibile esaminare sia batteri in coltura sia frammenti di tessuti.
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[modifica] Significato biologico della colorazione
La differenza nella capacità di trattenere il colorante basico è data dalla quantità di peptidoglicano (mureina) contenuto nella parete cellulare: i Gram-positivi presentano aminozuccheri N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico, ai quali sono legate corte catene di aminoacidi, che conferiscono stabilità e consistenza a tale strato; i Gram-negativi presentano invece una parete più sottile, ricca di lipopolisaccaridi e lipoproteine.
[modifica] Procedura
- Si pone nella piastra di coltura un colorante basico (idrofilo) (tra i più usati anche violetto di genziana o cristalvioletto e il violetto di nicolle).
- Passati tre minuti, si opera un lavaggio con liquido di Lugol (una soluzione di iodio e ioduro di potassio), che reagisce con il colorante basico formando un composto liposolubile, che si lascia agire per circa un minuto.
- Successivamente il materiale organico viene lavato con una soluzione decolorante (alcool etilico o simili) e infine con acqua.
A questo punto:
- i batteri Gram + avranno trattenuto il colorante basico (viola), poiché l'alcool non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare (idrofila), che non permette al colorante di passare.
- mentre i Gram - sono grigiastri, privi di colorazione, questo perché l'alcool ha sciolto i lipidi della membrana esterna danneggiando la sottile parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso cristal violetto - ioduro (liposolubile).
- infine, per far risaltare meglio la differenza si colora quindi il materiale con un colorante di contrasto, in genere safranina o fucsina (o eosina). La safranina colora le cellule in rosso e l'eosina in rosa.
Queste sostanze possono penetrare solo in cellule decolorate poiché, anche se solo modestamente idrofile, sono in grado di passare la parete cellulare grazie alle loro ridotte dimensioni.
Dopo questo passo finale, i batteri Gram+ hanno colore violetto, mentre i Gram- hanno color rosso o rosa, o alcune volte giallastro.
Le colture batteriche molto vecchie tendono a trattenere meno il colorante, apparendo meno Gram-positive di quanto siano in realtà; alcune (poche) specie di batteri inoltre non danno un responso chiaro alla colorazione, e sono dette Gram-variabili.
La colorazione di Gram è una colorazione di tipo regressivo in quanto, dopo una prima colorazione generale con violetto di nicole o di genziana, avverrà una decolorazione dei batteri Gram- con dell'alcool etilico puro, per poi essere ricolorati utilizzando della safranina.
[modifica] Colorazione di Gram di alcuni microrganismi comuni
| Famiglia | Gram | Aspetto | Informazioni | Rappresentanti |
|---|---|---|---|---|
| Micrococchi | + | cocchi a grappoli, ammassi | nelle salamoie, utili per la stagionatura degli alimenti | |
| Stafilococchi | + | cocchi a grappoli, cubi (sarcine) | patogeni nel latte e derivati. Producono tossine. | Staphylococcus aureus |
| Bacilli | + | bastoncelli | provocano alterazioni in molti alimenti. Responsabili del carbonchio. | Bacillus Antracis |
| Clostridium | + | bastoncelli | provocano putrefazione e producono tossine negli scatolami | Clostridium tetani, Clostridium botulinum |
| Batteri propionici (corynebacteriaceae) | + | bastoncelli | danno le occhiature a formaggi come l'emmental o il grana | |
| Micobatteri | - | bastoncelli | possono provocare o aggravare la tubercolosi o la lebbra | Mycobacterium tubercolosis |
| Brucella | - | bastoncelli | sulla pelle e nelle mucose | |
| Enterobatteri | - | bastoncelli | possono provocare diverse patologie a partenza gasrto-intestinale. | Escherichia coli |
| Pseudomonas | - | bastoncelli | patogeni, nell'acqua e nel suolo | Pseudomonas aeruginosa |
| Aeromonas | - | bastoncelli | patogeni, nell'acqua e nel suolo | |
| Ralstonia metallidurans | - | bacilli | sopravvivono anche in presenza di metalli pesanti |
[modifica] Batteri Gram negativi
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Per approfondire, vedi Batteri Gram-negativi. |
La parete delle cellule dei batteri Gram negativi è molto complessa, la membrana esterna si trova al di fuori dello strato di peptidoglicano, e la proteina presente in maggior quantità è la lipoproteina di Brown, che presenta una terminazione idrofobica tramite la quale si lega alla membrana esterna. In questo modo la lipoproteina funge da legante fra la membrana esterna e lo strato di peptidoglicano. La membrana esterna presenta molte molecole grosse e complesse, denominate “lipopolisaccaridi (LPS)” suddivisi in tre complessi distinti:
- La regione del lipide A: costituita da un disaccaride con attaccati a ciascun carboidrato tre acidi grassi e fosfato, una cui parte si proietta dalla superficie verso l'esterno, mentre il resto del complesso è ancorato alla membrana esterna.
- Il nucleo polisaccaridico(o core): costituito da una catena di 10 zuccheri, è legato al lipide A. Esso contiene in genere zuccheri e fosfati caricati elettricamente, perciò contribuisce a rendere negativa la carica della superficie batterica.
- La catena laterale O, o antigene O: costituito da una corta catena polisaccaridica che si proietta dal nucleo verso l’esterno; a seconda del ceppo batterico varia la sua composizione.
Gli anticorpi della cellula ospite sono in grado di riconoscere le catene laterali O, ma i batteri Gram negativi sono in grado di modificare la natura delle catene laterali in modo da contrastare le difese dell’ospite.
Questo tipo di batteri è più resistente agli antibiotici perché nel periplasma sono presenti enzimi come la beta-lattamasi che distrugge l'anello beta-lattamico di alcuni antibiotici tra cui la penicillina.
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