Colorazione di Gram

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La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che dà ragione della classificazione dei batteri in Gram-positivi e Gram-negativi (anche indicati come Gram+ e Gram-).
Fu messa a punto nel 1884 dal medico danese Hans Joachim Christian Gram, e mette in evidenza alcune proprietà fondamentali della parete cellulare dei microrganismi.

Con tale metodo è possibile esaminare sia batteri in coltura sia frammenti di tessuti.

Significato biologico della colorazione[modifica | modifica sorgente]

Colonia di Bacillus cereus (Gram +)
Colonia di Escherichia coli (Gram -)

La differenza nella capacità di trattenere il colorante basico è data dalla quantità di peptidoglicano (mureina) contenuto nella parete cellulare: i Gram-positivi presentano aminozuccheri N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico, ai quali sono legate corte catene di aminoacidi, che conferiscono stabilità e consistenza a tale strato; i Gram-negativi presentano invece una parete più sottile, ricca di lipopolisaccaridi e lipoproteine.

Procedura[modifica | modifica sorgente]

  • Si pone nella piastra di coltura un colorante basico (idrofilo) (tra i più usati anche violetto di genziana o cristalvioletto e il violetto di nicolle).
  • Passati tre minuti, si opera un lavaggio con liquido di Lugol (una soluzione di iodio e ioduro di potassio) denominata mordenzante - con il ruolo di fissare la prima colorazione, che reagisce con il colorante basico formando un composto liposolubile, che si lascia agire per circa un minuto.
  • A questo punto il preparato si lascia agire per 20 secondi con un decolorante (alcol-acetone)
  • Il preparato viene coperto da un secondo colorante, che può essere fucsina o safranina e che dona un colore rosastro alle cellule che non hanno fissato il primo colorante violaceo.
  • A questo punto:
  • i batteri Gram + avranno trattenuto il colorante basico (viola), poiché l'alcool non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare (idrofila), che non permette al colorante di passare.
  • mentre i Gram - sono di colore rosastro, questo perché l'alcool ha sciolto i lipidi della membrana esterna danneggiando la sottile parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso cristal violetto - ioduro (liposolubile).

Questo in quanto la prima colorazione - cristalvioletto riesce a penetrare la parete cellulare dei batteri Gram+, dove viene fissato con il contributo del mordenzante. Ma non attraversa la membrana esterna "asimmetrica" (fosfolipidica verso l'interno e lipopolisaccaridica verso l'esterno), dei gram-, la quale viene colorata dal secondo colorante fucsina-safranina in rosa (di diversi gradi)


Dopo questo passo finale, i batteri Gram+ hanno colore violetto, mentre i Gram- hanno color rosso o rosa, o alcune volte giallastro.

Le colture batteriche molto vecchie tendono a trattenere meno il colorante, apparendo meno Gram-positive di quanto siano in realtà; alcune (poche) specie di batteri inoltre non danno un responso chiaro alla colorazione, e sono dette Gram-variabili.

La colorazione di Gram è una colorazione di tipo regressivo in quanto, dopo una prima colorazione generale con violetto di nicole o di genziana, avverrà una decolorazione dei batteri Gram- con dell'alcool etilico puro, per poi essere ricolorati utilizzando della safranina.

Colorazione di Gram di alcuni microrganismi comuni[modifica | modifica sorgente]

Famiglia Gram Aspetto Informazioni Rappresentanti
Micrococchi + cocchi a grappoli, ammassi nelle salamoie, utili per la stagionatura degli alimenti
Stafilococchi + cocchi a grappoli, cubi (sarcine) patogeni nel latte e derivati. Producono tossine. Staphylococcus aureus
Bacilli + bastoncelli provocano alterazioni in molti alimenti. Responsabili del carbonchio. Bacillus Antracis
Clostridium + bastoncelli provocano putrefazione e producono tossine negli scatolami Clostridium tetani, Clostridium botulinum
Batteri propionici (corynebacteriaceae) + bastoncelli danno le occhiature a formaggi come l'emmental o il grana
Micobatteri + bastoncelli possono provocare la tubercolosi o la lebbra Mycobacterium tubercolosis
Brucella - bastoncelli sulla pelle e nelle mucose
Enterobatteri - bastoncelli possono provocare diverse patologie a partenza gastro-intestinale. Escherichia coli
Pseudomonas - bastoncelli patogeni, nell'acqua e nel suolo Pseudomonas aeruginosa
Aeromonas - bastoncelli patogeni, nell'acqua e nel suolo
Ralstonia metallidurans - bacilli sopravvivono anche in presenza di metalli pesanti

Batteri Gram negativi[modifica | modifica sorgente]

Exquisite-kfind.png Per approfondire, vedi Batteri Gram-negativi.

La parete delle cellule dei batteri Gram negativi è molto complessa, la membrana esterna si trova al di fuori dello strato di peptidoglicano, e la proteina presente in maggior quantità è la lipoproteina di Brown, che presenta una terminazione idrofobica tramite la quale si lega alla membrana esterna. In questo modo la lipoproteina funge da legante fra la membrana esterna e lo strato di peptidoglicano. La membrana esterna presenta molte molecole grosse e complesse, denominate “lipopolisaccaridi (LPS)” suddivisi in tre complessi distinti:

  • La regione del lipide A: costituita da un disaccaride con attaccati a ciascun carboidrato tre acidi grassi e fosfato, una cui parte si proietta dalla superficie verso l'esterno, mentre il resto del complesso è ancorato alla membrana esterna.
  • Il nucleo polisaccaridico(o core): costituito da una catena di 10 zuccheri, è legato al lipide A. Esso contiene in genere zuccheri e fosfati caricati elettricamente, perciò contribuisce a rendere negativa la carica della superficie batterica.
  • La catena laterale O, o antigene O: costituito da una corta catena polisaccaridica che si proietta dal nucleo verso l’esterno; a seconda del ceppo batterico varia la sua composizione.

Gli anticorpi della cellula ospite sono in grado di riconoscere le catene laterali O, ma i batteri Gram negativi sono in grado di modificare la natura delle catene laterali in modo da contrastare le difese dell’ospite.

Questo tipo di batteri è più resistente agli antibiotici perché nel periplasma sono presenti enzimi come la beta-lattamasi che distrugge l'anello beta-lattamico di alcuni antibiotici tra cui la penicillina.

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