Beta-glucuronidasi

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Beta-glucuronidasi
Modello tridimensionale dell'enzima
Omotetramero di glucuronidasi
(ritenuto l'unità biologica)[1]
Numero EC 3.2.1.31
Classe Idrolasi
Banche dati BRENDA, EXPASY, GTD, KEGG, PDB
Fonte: IUBMB
Beta-glucuronidasi
Struttura chimica
L'unità asimmetrica di β-glucuronidasi che mostra il sito attivo con residui Glu451, Tyr504, e Glu540, insieme con il residuo potenzialmente di supporto Asn450[1]
Gene
HUGO GUSB 4696
Entrez 2990
Locus Chr. 7 q11.21
Proteina
OMIM 611499
UniProt P08236
Enzima
EC number 3.2.1.31


Le beta-glucuronidasi sono enzimi membri della famiglia delle glicosidasi che catalizzano la trasformazione dei carboidrati complessi.[2] La β-glucuronidasi umana è un tipo di glucuronidasi (un membro della famiglia glicosidasi che catalizza l'idrolisi dei residui di acido β-D-glucuronico dall'estremità non riducente dei mucopolisaccaridi (chiamati anche glicosaminoglicani) come ad esempio l'eparan solfato.[2][3][4] La β-glucuronidasi umana si trova nel lisosoma.[5][6] Nell'orletto a spazzola dell'intestino l'enzima converte la bilirubina coniugata nella forma non coniugata per il riassorbimento. La β-glucuronidasi è presente anche nel latte materno e contribuisce al manifestarsi dell'ittero neonatale.

Struttura[modifica | modifica sorgente]

La β-glucuronidasi umana è sintetizzata come un monomero di 80 kDa (653 amminoacidi) prima che una proteolisi rimuova 18 amminoacidi dall'estremità C-terminale per formare un monomero di 78 kDa.[7][8] La β-glucuronidasi esiste come un omotetramero di 332 kDa.[9] La β-glucuronidasi umana contiene diverse formazioni strutturali importanti, tra cui un tipo di barile (β-barrel) noto come barile "jelly roll" ed un barile TIM.

Meccanismi di catalisi[modifica | modifica sorgente]

La β-glucuronidasi umana è omologa all'enzima β-galattosidasi di Escherichia coli.[10][11] Questa relazione omologa, insieme con la conoscenza che le glicosidasi eseguono spesso un'idrolisi catalizzata da due residui acidi, ha permesso lo sviluppo di una ipotesi meccanicistica. Secondo questa ipotesi i due residui di acido glutammico Glu540 e Glu451 sono i residui nucleofili e acidi, rispettivamente, e il residuo di tirosina Tyr504 verrebbe anch'esso coinvolto nella catalisi.
A sostegno di questa ipotesi, mutazioni indotte sperimentalmente su uno qualsiasi di questi tre residui comportano importante diminuzione dell'attività enzimatica. Al contrario l'aumento dell'attività di un enzima mutante E451A (dove Glu451 viene sostituito con un residuo di alanina) dopo l'aggiunta di azide è coerente con il fatto che Glu451 rappresenta il residuo acido/base.[12] Ulteriori studi eseguiti ricorrendo all'analisi di peptidi marcati di β-glucuronidasi, dopo idrolisi di un substrato che entra in una fase intermedia molto stabile, hanno permesso ai ricercatori di determinare che Glu540 è il residuo nucleofilo.[13]

Anche se il particolare tipo di sostituzione nucleofila impiegato dalla β-glucuronidasi non è ancora chiaro, evidenze inerenti i meccanismi utilizzati dai loro omologhi della famiglia delle glicosidasi suggeriscono che queste reazioni siano qualitativamente reazioni SN2.
Le reazioni procedono attraverso uno stato di transizione con caratteristici carbocationi. Inizialmente, questi meccanismi, a causa di questo carbocatione caratteristico dello stato di transizione, si pensava fossero reazioni SN1 che procedevano attraverso un discreto "ione carbonio" intermedio. Tuttavia, evidenze più recenti suggeriscono che questi stati di carbocatione abbiano una durata variabile dai 10 femtosecondi agli 0.1 nanosecondi (simile a quella di un periodo di vibrazione di legame). Queste vite sono temporalmente troppo brevi per dare luogo a un intermedio di reazione. Ne consegue, da questa evidenze, che queste reazioni, pur avendo un aspetto SN1 causa della presenza caratteristica del carbocatione dei loro stati di transizione, debbano essere qualitativamente reazioni SN2.[2]

L'attività specifica di Tyr504 nel meccanismo catalitico è invece chiara. Raffrontando i dati strutturali dell'enzima omologo xilanasi, è stato suggerito che Tyr504 della β-glucuronidasi potrebbe stabilizzare il nucleofilo (Glu540) o modularne l'attività.[14]

In aggiunta a questi residui, un residuo conservato di asparagina (denominato Asn450) è stato suggerito che eserciti un'azione di stabilizzazione del substrato grazie alla presenza di un legame idrogeno al gruppo 2-idrossilico del substrato zucchero.[9][15]

Sindrome di Sly[modifica | modifica sorgente]

Exquisite-kfind.png Per approfondire, vedi sindrome di Sly.

La carenza di β-glucuronidasi comporta la malattia metabolica ereditaria, non recessiva, nota come sindrome di Sly o Mucopolisaccaridosi VII. Una carenza di questo enzima provoca l'accumulo di mucopolisaccaridi non idrolizzati nell'organismo del paziente. Questa malattia può essere estremamente debilitante per il paziente o può causare idrope fetale prima della nascita. Nei pazienti che sopravvivono è possibile osservare ritardo mentale, bassa statura, caratteristiche facciali grossolane, anormalità spinali, epatomegalia e splenomegalia.[5] Questa malattia è stata riscontrata anche in un ceppo di topi così come in una famiglia di cani.[16][17] Più recentemente i ricercatori hanno scoperto una famiglia felina che presenta anch'essa carenze dell'attività β-glucuronidasi.
La fonte di questa riduzione di attività è stata identificata come una mutazione E351K (Glu351 è mutato ad un residuo di lisina). Glu351 è conservata nei mammiferi, la qual cosa suggerisce una funzione importante per questo residuo. Un esame a raggi X della struttura cristallina umana suggerisce che questo residuo (Glu352 nell'enzima umano), che è sepolto in profondità all'interno del dominio barile TIM, può essere importante per la stabilizzazione della struttura terziaria dell'enzima.[18]
Nella struttura cristallina, sembra che Arg216, un membro del dominio "jelly roll" della proteina, formi un ponte salino con Glu352. Pertanto, Glu352 è probabilmente coinvolta nello stabilizzare l'interazione tra due differenti domini tridimensionali dell'enzima.[1]

Applicazioni molecolari: uso come gene reporter[modifica | modifica sorgente]

In biologia molecolare, la β-glucuronidasi è utilizzata come gene reporter per monitorare l'espressione genica in cellule di mammiferi e vegetali. Il monitoraggio dell'attività della β-glucuronidasi attraverso l'uso di un saggio GUS permette di determinare l'espressione spaziale e temporale del gene in questione.[19] Immagini grafiche molecolari sono state prodotte utilizzando il pacchetto UCSF Chimera dal dipartimento risorse per Biocomputing, Visualizzazione e Informatica presso l'Università della California, San Francisco.

Note[modifica | modifica sorgente]

  1. ^ a b c S. Jain, WB. Drendel; ZW. Chen; FS. Mathews; WS. Sly; JH. Grubb, Structure of human beta-glucuronidase reveals candidate lysosomal targeting and active-site motifs. in Nat Struct Biol, vol. 3, nº 4, aprile 1996, pp. 375-81, PMID 8599764.
  2. ^ a b c Michael, ed. Sinnott, Comprehensive Biological Catalysis, vol. 1, Manchester, UK, Academic Press, 1998, pp. 119–138, ISBN 0-12-646864-8.
  3. ^ JD. McCarter, SG. Withers, Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis in Curr Opin Struct Biol, vol. 4, nº 6, Dic 1994, pp. 885-92, PMID 7712292.
  4. ^ Sinnott ML, Catalytic mechanisms of enymatic glycosyl transfer in Chem Rev, vol. 90, 1990, pp. 1171–1202, DOI:10.1021/cr00105a006.
  5. ^ a b William L. Nyhan, Bruce Barshop, Pinar Ozand, Atlas of Metabolic Diseases, 2ª ed., London, UK, Hodder Arnold, 2005, pp. 501–503, 546–550, ISBN 0-340-80970-1.
  6. ^ JL. Van Lancker, PL. Lentz, Study on the site of biosynthesis of beta-glucuronidase and its appearance in lysosome in normal and hypoxic rats. in J Histochem Cytochem, vol. 18, nº 8, Ago 1970, pp. 529-41, PMID 5449980.
  7. ^ MR. Islam, JH. Grubb; WS. Sly, C-terminal processing of human beta-glucuronidase. The propeptide is required for full expression of catalytic activity, intracellular retention, and proper phosphorylation. in J Biol Chem, vol. 268, nº 30, Ott 1993, pp. 22627-33, PMID 8226771.
  8. ^ JM. Shipley, JH. Grubb; WS. Sly, The role of glycosylation and phosphorylation in the expression of active human beta-glucuronidase. in J Biol Chem, vol. 268, nº 16, Giu 1993, pp. 12193-8, PMID 8505339.
  9. ^ a b Kim HW, Mino K, Ishikawa K, Crystallization and preliminary X-ray analysis of endoglucanase from Pyrococcus horikoshii in Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., vol. 64, Pt 12, Dic 2008, pp. 1169–71, DOI:10.1107/S1744309108036919, PMC 2593689, PMID 19052378.
  10. ^ B. Henrissat, A. Bairoch, New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. in Biochem J, 293 ( Pt 3), Ago 1993, pp. 781-8, PMID 8352747.
  11. ^ B. Henrissat, A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. in Biochem J, 280 ( Pt 2), Dic 1991, pp. 309-16, PMID 1747104.
  12. ^ MR. Islam, S. Tomatsu; GN. Shah; JH. Grubb; S. Jain; WS. Sly, Active site residues of human beta-glucuronidase. Evidence for Glu(540) as the nucleophile and Glu(451) as the acid-base residue. in J Biol Chem, vol. 274, nº 33, Ago 1999, pp. 23451-5, PMID 10438523.
  13. ^ AW. Wong, S. He; JH. Grubb; WS. Sly; SG. Withers, Identification of Glu-540 as the catalytic nucleophile of human beta-glucuronidase using electrospray mass spectrometry. in J Biol Chem, vol. 273, nº 51, Dic 1998, pp. 34057-62, PMID 9852062.
  14. ^ EzCatDB: T00066 in EzCatDB: A Database of Catalytic Mechanisms. URL consultato il 2 febbraio 2014.
  15. ^ B. Henrissat, I. Callebaut; S. Fabrega; P. Lehn; JP. Mornon; G. Davies, Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases. in Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 92, nº 15, Lug 1995, pp. 7090-4, PMID 7624375.
  16. ^ EH. Birkenmeier, MT. Davisson; WG. Beamer; RE. Ganschow; CA. Vogler; B. Gwynn; KA. Lyford; LM. Maltais; CJ. Wawrzyniak, Murine mucopolysaccharidosis type VII. Characterization of a mouse with beta-glucuronidase deficiency. in J Clin Invest, vol. 83, nº 4, aprile 1989, pp. 1258-66, DOI:10.1172/JCI114010, PMID 2495302.
  17. ^ ME. Haskins, RJ. Desnick; N. DiFerrante; PF. Jezyk; DF. Patterson, Beta-glucuronidase deficiency in a dog: a model of human mucopolysaccharidosis VII. in Pediatr Res, vol. 18, nº 10, Ott 1984, pp. 980-4, PMID 6436780.
  18. ^ JC. Fyfe, RL. Kurzhals; ME. Lassaline; PS. Henthorn; PR. Alur; P. Wang; JH. Wolfe; U. Giger; ME. Haskins; DF. Patterson; H. Sun, Molecular basis of feline beta-glucuronidase deficiency: an animal model of mucopolysaccharidosis VII. in Genomics, vol. 58, nº 2, Giu 1999, pp. 121-8, DOI:10.1006/geno.1999.5825, PMID 10366443.
  19. ^ SV. Marathe, JE. McEwen, Vectors with the gus reporter gene for identifying and quantitating promoter regions in Saccharomyces cerevisiae. in Gene, vol. 154, nº 1, febbraio 1995, pp. 105-7, PMID 7867935.