Utente:Annamaria.dmr/primer
Un primer è un filamento di acido nucleico che serve come punto di innesco per la replicazione del DNA. I primer sono necessari perché molte DNA-polimerasi (enzimi che catalizzano la replicazione del DNA) non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento "ex novo", ma possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento pre-esistente. In natura, generalmente, è l'RNA che viene usato come primer, perché le RNA-polimerasi (enzimi che catalizzano la trascrizione del RNA) sono in grado di iniziare la sintesi di una nuova catena senza ricorrere ad un innesco. Gli inneschi vengono sintetizzati da RNA-polimerasi specializzate, chiamate primasi, le quali, dopo la denaturazione della doppia elica, ad opera del'enzima elicasi e delle proteine destabilzzatrici della doppia elica, si legano ai filamenti stampo e iniziano a sintetizzare corti frammenti di RNA. Su entrambi i lati della forca di replicazione, i primer sono assemblati in direzione 5'-->3'. La DNA-polimerasi aggiunge i desossiriboncleotidi a partire dall'estremità 3' libera del primer. Dopo aver svolto il loro compito, i primer sono degradati ad opera della polimerasi I, che possiede anche un'attività esonucleasica, o di RNAasi H specializzate. Dopo la rimozione dei primer, lungo il filamento di DNA si vengono a creare dei vuoti, che sono colmati ad opera della DNA-polimerasi I, nei procarioti,e dalla DNA-polimerasi α negli eucarioti. Infine, l'interruzione viene saldata dall'enzima ligasi.
Uso di primer sintetici in biologia molecolare[modifica | modifica wikitesto]
I primer sono utilizzati in molte tecniche di biologia moleolare che richiedono la DNA-polimerasi, come in alcune tecniche di sequenziamento del DNA e nella reazione a catena della polimerasi o PCR. I primer usati in queste tecniche sono dei corti frammenti di DNA, della lunghezza di 18-20 basi. Questi inneschi sono costruiti in laboratorio, attraverso complesse sintesi chimiche.
Una tecnica di sequenziamento del DNA che utilizza i primer sintetici è quella di Sanger, un metodo enzimatico con il quale corti frammenti di DNA interrotti, alternativamente, in corrispondenza di uno dei quattro nucleotidi sono sintetizzati dalla DNA polimerasi I, che richiede la presenza di primer, i quali devono essere aggiunti alla miscela di reazione. Questi primer possono essere marcati con sostanze fluorescenti per visualizzare i frammenti corrispondenti, dopo la loro separazione su gel di agarosio.
Un altra tecnica che utilizza i primer è quella della reazione a catena dela polimerasi, o PCR, che è una metodica che permette l'amplificazione di alcuni framenti di DNA. Durante la fase di amplificazione vengono utilizzati i primer, i quali aderiscono al DNA (fase di annealing) in corrispondenza dei framenti da amplificare e servono da innesco per la DNA polimerasi.
Costruzione di primer per PCR[modifica | modifica wikitesto]
La costruzione di primer richiede il controllo di alcuni parametri, uno dei più importanti è la temperatura di melting del primer, che è la temperatura alla quale il 50% delle molecole si trova in forma di doppia elica stabile ed il restante 50% in forma di singola elica.
Esistono primer forward e primer reverse, a seconda se sono complementari al filamento 3'-->5' o a quello inverso 5'-->3'. Nella costruzione dei primer è necessario prestare attenzione al fatto che sia il forward sia il reverse devono avere la stessa temperatura di melting e di annealing (o temperatura molto vicine, solitamente 1 o 2 gradi massimo), quindi i due primer devono avere all'incirca lo stesso contenuto in AT (o in CG). La pratica insegna che i primer che danno i risultati migliori in una reazione a catena della polimerasi sono quelli che al 3' hanno un certo numero di C o G, perché sono quelli che si legano più fortemente al dna stampo, mentre quelli che terminano al 3' con A o T sono meno sicuri in quanto la loro ibridizzazione con il DNA stampo è meno forte.
La temperatura di melting aumenta con l'aumentare della lunghezza del primer. Primer troppo corti potrebbero essere poco specifici ed ibridizzare in posizioni diverse del DNA stampo; d'altra parte primer con temperature di melting troppo alte possono creare problemi alla DNA polimerasi, che è meno attiva a temperature superiori a 80°C. La lunghezza ottimale di un primer è generalmente compresa tra 20 e 30 nucleotidi, con temperature di melting comprese tra 55 e 65°C.
Le sequenze dei primer devono essere scelte in modo tale che l'annealing avvenga solo con le sequenze d'interesse del DNA stampo, evitanto l'adesione a sequenze simili, con la conseguente perdita di specificità. Inoltre dovrebbe essere evitata la presenza di nucleotidi ripetuti o sequenze complementari all'interno dello stesso primer, per evitare la formazione di loop, o forcine. Anche l'ibridizzazione tra primer diversi, per la presenza di sequenze ripetute e invertite, con formazione di dimeri, determina una diminuzione dell'efficienza dell' annealing.
A volte si possono utilizzare primer degenerati, che sono dei mixer di molecole simili, ma non identiche, le quali differiscono per alcuni nucleotidi all'interno della loro sequenza. Primer degenerati risultano utili, ad esempio, quando si devono amplificare gli stessi geni provenienti da organismi diversi, che hanno sequenze simili, ma non identiche, oppure quando la sequenza del gene è stata ricavata dalla sequenza della proteina corrispondente, tenendo conto della degenerazione del codice genetico. Un altro uso di primer degenerati è quello relativo al campo dell'ecologia microbica, per permettere l'amplificazione di geni di microrganismi di cui non è ancora nota l'informazione genomica.
Esistono in rete banche dati alle quali i laboratori di biologia molecolare possono riferirsi per scegliere le sequenze di primer più adatte alla loro ricerca.
