Microscopio a fluorescenza

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Un microscopio a fluorescenza (Olympus BX61), accoppiato ad una fotocamera digitale.

Un microscopio a fluorescenza, è un microscopio ottico utilizzato per studiare campioni organici o inorganici sfruttando i fenomeni della fluorescenza e della fosforescenza indotti nel campione. I microscopi ottici tradizionali sfruttano invece fenomeni come la riflessione o l'assorbimento della luce direttamente illuminante il campione osservato.[1][2]

Un microscopio a fluorescenza invertito (Nikon TE2000). Notare la piattaforma arancione che consente all'operatore di vedere il campione, ma che lo protegge al contempo dalla luce UV utilizzata per l'eccitazione.

La tecnica[modifica | modifica sorgente]

I primi utilizzi pratici della tecnica provenivano dall'esperienza relativa all'utilizzo di luce ultravioletta nell'osservazione di campioni microscopici. I problemi derivanti dall'utilizzo di lunghezze d'onda invisibili all'occhio umano spostarono presto l'attenzione verso l'osservazione dei fenomeni di fluorescenza indotti nel campione dalle stesse radiazioni. I successivi utilizzi passarono per l'osservazione di preparati naturalmente passibili di fluorescenza, in genere con strumenti a luce trasmessa, ma col tempo, per differenti motivazioni inerenti all'ottica strumentale si passò al microscopio ad epifluorescenza, con la sorgente non allineata con l'osservatore. Il passo successivo fu la marcatura di campionioni non fluorescenti, e l'utilizzo di lunghezze d'onda non necessariamente nello spettro UV.
Nell'utilizzo più diffuso attualmente, il componente di interesse nel campione viene marcato in maniera specifica con una molecola fluorescente, detta fluoroforo (alcuni esempi sono la GFP, la fluoresceina o il DyLight Fluor).[1] Il campione viene quindi illuminato con un fascio di luce ad una specifica lunghezza d'onda, che viene assorbita dal fluoroforo, causandone l'emissione di luce a lunghezze d'onda maggiori (e quindi di colore diverso dalla luce assorbita). La luce eccitante viene separata dalla luce emessa, che è molto più debole, grazie all'uso di un filtro. I componenti tipici di un microscopio a fluorescenza sono: una sorgente di luce (lampada ad arco allo xeno o ai vapori di mercurio), un filtro di eccitazione, uno specchio dicroico, e un filtro di emissione. I filtri e gli specchi dicroici sono scelti in base alle caratteristiche di eccitazione ed emissione del fluoroforo utilizzato.[1] In questo modo si può osservare un singolo colore alla volta. Si possono comporre immagini a più colori combinando fra loro le immagini a singolo colore realizzate con differenti fluorofori.[1]

Gran parte dei microscopi a fluorescenza utilizzati sono microscopi ad epifluorescenza dove l'eccitazione e l'osservazione della fluorescenza avvengono da sopra (epi–) il campione, e comunque fuori asse con l'osservatore. Questi microscopi sono diventati importanti strumenti nel campo della biologia, aprendo le porte alla progettazione di microscopi sempre più avanzati e complessi, come il microscopio confocale e il TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscope. Il Vertico SMI combina infine la microscopia con la modulazione spaziale dell'illuminazione raggiungendo risoluzioni inferiori ai 10 nanometri (1 nanometro = 1 nm = 1 × 10−9 m).[3][4][5].

I fluorofori possono perdere le loro caratteristiche di fluorescenza quando illuminati, il processo è detto photobleaching. Per evitare il photobleaching si possono adottare diversi provvedimenti: ad esempio, possono essere usati fluorofori più resistenti, si può minimizzare l'illuminazione, o, in alternativa, si può utilizzare un particolare tipo di reazione chimica nota come scavenger chemistry[non chiaro].

Microscopia ad epifluorescenza[modifica | modifica sorgente]

Immagine schematica di un microscopio a fluorescenza.

La microscopia ad epifluorescenza è un particolare metodo di microscopia a fluorescenza largamente utilizzato nell'ambito della biologia. La luce di eccitazione proviene da sopra (o da sotto, nei microscopi invertiti) il campione e attraversa l'obiettivo prima e poi il campione stesso. La fluorescenza che origina dal campione crea la cosiddetta luce di emissione che viene focalizzata su un rivelatore dallo stesso obiettivo attraverso cui è passato il fascio di eccitazione. La luce di eccitazione è rimossa dal segnale emesso dal campione mediante un filtro, posto tra l'obbiettivo e il rivelatore.

Immagini[modifica | modifica sorgente]

Note[modifica | modifica sorgente]

  1. ^ a b c d Spring KR, Davidson MW, Introduction to Fluorescence Microscopy in Nikon MicroscopyU. URL consultato il 28 settembre 2008.
  2. ^ The Fluorescence Microscope in Microscopes—Help Scientists Explore Hidden Worlds, The Nobel Foundation. URL consultato il 28 settembre 2008.
  3. ^ Nano-structure analysis using Spatially Modulated Illumination microscopy: D. Baddeley, C. Batram, Y. Weiland, C. Cremer, U.J. Birk in NATURE PROTOCOLS, Vol 2, pp. 2640–2646 (2007)
  4. ^ High-precision structural analysis of subnuclear complexes in fixed and live cells via Spatially Modulated Illumination (SMI) microscopy: J. Reymann, D. Baddeley, P. Lemmer, W. Stadter, T. Jegou, K. Rippe, C. Cremer, U. Birk in CHROMOSOME RESEARCH, Vol. 16, pp. 367 –382 (2008)
  5. ^ SPDM – Light Microscopy with Single Molecule Resolution at the Nanoscale: P. Lemmer, M.Gunkel, D.Baddeley, R. Kaufmann, A. Urich, Y. Weiland, J.Reymann, P. Müller, M. Hausmann, C. Cremer in APPLIED PHYSICS B, Vol 93, pp. 1-12 (2008).

Altre fonti[modifica | modifica sorgente]

  • Bradbury, S. and Evennett, P., Fluorescence microscopy., Contrast Techniques in Light Microscopy., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, United Kingdom (1996).
  • Rost, F., Quantitative fluorescence microscopy. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (1991).
  • Rost, F., Fluorescence microscopy. Vol. I. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (1992). Reprinted with update, 1996.
  • Rost, F., Fluorescence microscopy. Vol. II. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (1995).
  • Rost, F. and Oldfield, R., Fluorescence microscopy., Photography with a Microscope, Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (2000).

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