Splicing

Esoni e introni. L'mRNA maturo è formato dai soli esoni.

Il termine splicing (in italiano letteralmente "saldatura") indica uno dei processi, insieme al capping e alla poliadenilazione, di maturazione del trascritto primario dei geni discontinui.

La maggior parte dei geni eucariotici conta regioni presenti nel mRNA maturo (esoni) e altre non presenti (introni). Alcuni introni sono presenti anche nei geni degli archeobatteri, mentre sono assenti in quelli degli eubatteri. Dopo la trascrizione da parte della RNA polimerasi il trascritto primario va incontro a numerose modificazioni. Prima fra tutte l’eliminazione degli introni, denominata splicing.

Autosplicing

Alcuni rari introni sono capaci di "autocatalisi", ovvero la parte intronica dell'RNA trascritto è un "ribozima" che catalizza la propria escissione, con meccanismo diverso a seconda che l’introne sia di I o di II gruppo. Lo splicing degli introni del gruppo I necessita di un nucleoside guaninico, usato come nucleofilo: il suo –OH in 3’ si lega all’estremità 5’ dell’introne con un legame fosfodiesterico 3’-5’ al primo nucleoside dell’introne. L’ossidrile in 3’ dell’esone precedente agisce da nucleofilo completando la reazione e congiungendo i due esoni. Per gli introni del gruppo II, la reazione è simile, ma il primo nucleofilo ad agire non è un nucleoside esterno, bensì un –OH in 2’ di un residuo adenilato all’interno dell’introne. Questo meccanismo, definito "autocatalitico" perché può avvenire anche in completa assenza di proteine, riguarda rari introni di alcuni geni degli organelli degli eucarioti (gruppo II), dei geni nucleari codificanti l'rRNA di qualche eucariote (gruppo I) e di qualche gene procariotico (entrambi i gruppi). AL

Splicing catalizzato

Il terzo gruppo di introni, che è quello più comune e che riguarda la maggior parte degli introni dei geni nucleari degli eucarioti, mostra lo stesso meccanismo di formazione del cappio utilizzando una "A" interna all'introne, di solito prossima al 3', tuttavia necessita di complessi di RNA e proteine chiamati Piccole Ribonucleoproteine Nucleari (small nuclear ribonucleoproteins o snRNP) contenenti sequenze di 100-200 nucleotidi chiamati snRNA o RNA U. Quando il complesso si lega al trascritto primario si forma lo spliceosoma. Nonostante che, anche in questo caso, la catalisi sia portata avanti proprio da questi piccoli RNA, che agiscono quindi come ribozimi, il meccanismo è chiaramente assistito e quindi non autocatalitico.

Una quarta classe di introni, esemplificati da alcuni piccoli introni ritrovati nei geni che codificano tRNA in eucarioti inferiori, mostrano meccanismo molto diverso, che prevede un taglio dell'introne da parte di un enzima specifico endonucleasi, seguita da ricongiungimento degli esoni da parte di una RNA Ligasi ATP-dipendente ATP.

Esiste un ulteriore tipo catalizzato, chiamato trans-splicing che salda due esoni di trascritti primari differenti.

Queste ultime classi sono riscontrabili solo negli eucarioti.

Riconoscimento dell’introne

Nel caso degli introni del terzo gruppo, nella stragrande maggioranza dei casi gli introni iniziano con la sequenza GU e terminano con la sequenza AG; queste sequenze sono riconosciute dalle macchine molecolari che devono catalizzare la giuntatura, ovvero le snRNP. Tuttavia si è riscontrato che all’interno della sequenza intronica queste coppie possono ripetersi: quindi si è ipotizzato che gli spliceosomi riconoscano altre sequenze contigue. A questo riconoscimento partecipano numerose altre proteine accessorie che vanno sotto il nome generale di "RNA-binding proteins". Un numero molto piccolo di introni della terza classe presenta, invece, sequenze alternative AT-AC. In questo caso, esistono varianti speciali delle snRNP, in grado di riconoscere i confini di questi introni.

Splicing alternativo

Esempio di splicing alternativo, con formazione di due diversi mRNA maturi

Questa ricorrenza (non straordinaria) di coppie GU e AG, segnala un’altra possibilità. Gli introni possono essere escissi in maniere diverse, è il caso dello splicing alternativo - cioè il processo attraverso il quale, mediante un diverso arrangiamento degli esoni (regioni di RNA codificanti), da uno stesso gene possono derivare diverse proteine.

Per fare un esempio, ammettiamo di avere tre esoni (e1, e2, e3) intercalati da due introni (iI, iII), la cellula può decidere di eliminare iI e iII dando così vita al mRNA e1-e2-e3, oppure può eliminare iI e iII assieme all’esone centrale e2, formando così l’mRNA e1-e3. Ciò porterà alla traduzione di due proteine diverse. Ad esempio: se l’mRNA e1-e2-e3 codifica un recettore di membrana, dove e2 codifica la parte idrofobica del polipeptide transmembrana, l’mRNA e1-e3 codificherà una proteina simile alla prima ma incapace di fissarsi alla membrana. Se l’esone e3 contiene la sequenza che codifica la parte di proteina complementare ad un ormone, entrambe le proteine lo legheranno ma la prima agirà da recettore, la seconda, libera nell’ambiente extracellulare, da inibitore ormonale (perché sottrarrà ai recettori l’ormone), quindi in modi completamente opposti.

Si conta che ogni gene umano dia vita, in media, a 4 proteine diverse. Questo meccanismo di saldatura alternativa spiega, in parte, perché negli organismi superiori non ci sia un rapporto lineare tra numero di geni e complessità dell’organismo (=numero di proteine), che dipende anche dalla capacità di utilizzare più o meno diffusamente il meccanismo dello splicing alternativo.

Un meccanismo simile è implicato nell'espressione dei geni per le immunoglobuline dei linfociti. In tal modo è possibile produrre un'enorme varietà di anticorpi. Meccanismi di splicing alternativo si possono ritrovare anche nella Drosophila melanogaster: è stato individuato sul gene sxl, che ne determina il sesso.

Modalità di splicing alternativo

Classificazione tradizionale degli eventi di splicing alternativo.

Sono generalmente riconosciute cinque modalità di splicing alternativo.

• Salto dell'esone: in questo caso un esone può essere eliminato dal trascritto primario. Questa è la modalità più comune di splicing nel pre-mRNA dei mammiferi.

• Esone mutualmente esclusivo: solo uno di due esoni viene mantenuto nell'mRNA maturo, non entrambi.

• Sito di taglio alternativo 5' : viene usato un sito di taglio al 5' alternativo, cambiando l'estremità 3' dell'esone a monte.

• Sito di taglio alternativo 3' : viene usato un sito di taglio al 3' alternativo, cambiando l'estremità 5' dell'esone a valle.

• Introne trattenuto: i siti di taglio di un introne possono non essere riconosciuti. In questo caso l'introne non viene eliminato dal trascritto di mRNA. La differenza con il salto dell'esone sta nel fatto che la sequenza trattenuta non è fiancheggiata da introni. Se l'introne trattenuto si trova nella regione codificante, esso non deve alterare la cornice di lettura degli esoni. Se avviene il cambiamento di quest'ultima, esso potrebbe generare una proteina tronca o non funzionale.

Errori nello splicing

Mutazioni negli introni o negli esoni possono rendere impossibile la saldatura e ciò comporta un'alterazione nella sintesi proteica.

Errori comuni:

• Mutazione di un sito di saldatura e conseguente perdita della funzione del sito. Si traduce nella comparsa prematura di un codone di stop sull'esone, nella perdita di un esone, o nell'inclusione di un introne nell'RNA maturo.
• Mutazione di un sito di saldatura che ne riduce la specificità. Può causate lo spostamento del sito di saldatura, e dunque l'inserimento o la delezione di alcuni amminoacidi, o più frequentemente, la perdita del quadro di lettura.
• Transposizione di un sito di saldatura. Verranno incluse nell'RNA maturo più o meno basi rispetto alla norma. Gli esoni risulteranno, dunque, più corti o più lunghi.

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