Utente:Annamaria.dmr/prove

Primer

Un primer è un filamento di acido nucleico che serve come punto di innesco per la replicazione del DNA. I primer sono necessari perché molte DNA-polimerasi (enzimi che catalizzano la replicazione del DNA) non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento "ex novo", ma possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento pre-esistente. Generalmente è l'RNA che viene usato come primer, perché le RNA-polimerasi (enzimi che catalizzano la trascrizione del RNA) sono in grado di iniziare la sintesi di una nuova catena senza ricorrere ad un innesco. Gli inneschi vengono sintetizzati da RNA-polimerasi specializzate, chiamate primasi, le quali, dopo la denaturazione della doppia elica, ad opera del'enzima elicasi e delle proteine destabilzzatrici della doppia elica, si legano ai filamenti stampo e iniziano a sintetizzare corti frammenti di RNA. Su entrambi i lati della forca di replicazione, i primer sono assemblati in direzione 5'-->3'. La DNA-polimerasi aggiunge i desossiriboncleotidi a partire dall'estremità 3' libera del primer. Dopo aver svolto il loro compito, i primer sono degradati ad opera della polimerasi I, che possiede anche un'attività esonucleasica, o di RNAasi H specializzate. Dopo la rimozione dei primer, lungo il filamento di DNA si vengono a creare dei vuoti, detti "gap", che saranno colmati ad opera della DNA-polimerasi I, nei procarioti,e dalla DNA-polimerasi alfa; negli eucarioti. Infine, l'interruzione viene saldata dall'enzima ligasi.

Uso di primer sintetici nelle tecniche di biologia molecolare

I primer sono utilizzati in molte tecniche di laboratorio di biologia moleolare che coinvolgono la DNA-polimerasi, come le tecniche di sequenziamento del DNA e nella reazione a catena della polimerasi o PCR. I primer usati in queste tecniche sono dei corti frammenti di DNA, della lunghezza di 18-20 basi. Questi inneschi sono costruiti in laboratorio, attraverso sintesi chimiche. Poiché la sintesi di questi inneschi è piuttosto complessa, la maggior parte dei laboratori di biologia molecolare non produce i propri primer ma li ordina da ditte specializzate.

Una delle tecniche che utilizza i primer sintetici è la tecnica di sequenziamento del DNA di Sanger, che si basa su un metodo enzimatico e, quindi, utilizza la DNA polimerasi I per sintetizzare corti frammenti di DNA interrotti, alternativamente, in corrispondenza di uno dei quattro nucleotidi. la DNA polimerasi richiede la presenza di un primer, che quindi deve essere aggiunto alla miscela di reazione. Questi primer possono essere marcati con sostanze fluorescenti per visualizzare i frammenti corrispondenti, dopo la loro separazione su gel di agarosio.

Un altra tecnica che utilizza i primer è quella della reazione a catena dela polimerasi, o PCR, che è una metodica che permette l'amplificazione di alcuni framenti di DNA. Ed è proprio durante la fase di amplificazione che vengono utilizati i primer, i quali aderiscono al DNA (fase di annealing) in corrispondenza dei framenti da amplificare e servono da innesco per la DNA polimerasi.

Progettazione di primer per PCR

Esistono primer forward e primer reverse, a seconda se sono complementari al filamento 3'-->5' o a quello inverso 5'-->3'. Nella costruzione dei primer è necessario prestare attenzione al fatto che sia il forward sia il reverse devono avere la stessa temperatura di melting (che è la temperatura alla quale il 50% delle molecole si trovano in doppia elica e il 50% in singiola elica) e di annealing(o temperatura molto vicine, solitamente 1 o 2 gradi massimo), quindi i due primer devono avere all'incirca lo stesso contenuto in AT (o in CG). La pratica insegna che i primer che danno i risultati migliori in una reazione a catena della polimerasi sono quelli che al 3' hanno un certo numero di C o G, perché sono quelli che si legano più fortemente al dna stampo, mentre quelli che terminano al 3' con A o T sono meno sicuri in quanto la loro ibridizzazione con il DNA stampo è meno forte.

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