Elettroforesi su gel di agarosio

Vaschetta per elettroforesi su gel

Caricamento dei "pozzetti" del gel con il campione da analizzare

Particolare del caricamento dei "pozzetti"

Taglio del gel, sotto luce UV, per l'eventuale recupero delle sostanze separate

L'elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica che serve per analizzare e purificare il DNA tagliato precedentemente dagli enzimi di restrizione. Questa tecnica utilizza le cariche presenti nelle molecole di DNA (caricata negativamente) per farle correre attraverso un gel di selezione, costituito da una rete di pori, che ha la funzione di separare le molecole in base alla loro grandezza, quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità.

Struttura dell’agarosio

L’agarosio è un polisaccaride lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici. L’agarosio è uno zucchero solubile in acqua alla temperatura di ebollizione, mentre diventa solido man mano che si raffredda formando una matrice attraverso dei legami a idrogeno tra le catene lineari. L’agarosio non è l’unico utilizzato per questa tecnica infatti ne esistono di diversi tipi: amido, miscela agarosio-poliacrilammide (consente una più fine separazione delle molecole).

Caricamento dei campioni

I campioni da analizzare vanno depositati, con una micropipetta, in apposite fenditure verticali, dette "pozzetti", praticate nel gel a poca distanza dal margine dalla parte del polo negativo. Essendo il DNA un polianione i frammenti migreranno in avanti verso il polo positivo. All'atto del caricamento, al campione viene solitamente aggiunta una "soluzione di caricamento", colorata generalmente con blu di bromofenolo e Xilene cianolo, contenente glicerolo per agevolare la precipitazione del campione sul fondo del pozzetto.

Taratura del gel

L’elettroforesi su gel è una tecnica ideale per determinare le dimensioni dei frammenti di DNA digeriti con enzimi di restrizione. Per questo scopo è necessario costruire una curva di taratura in grado di fornire un valore approssimativo sulle reali dimensioni delle molecole di DNA. Per la taratura bisogna far migrare nel gel un marcatore contenete frammenti di DNA di dimensioni già note. Da questo si vede che esiste una relazione di linearità fra il logaritmo delle dimensioni del frammento e la distanza percorsa dal gel. Dalla curva di taratura è perciò possibile stabilire le dimensioni dei frammenti di DNA.

Colorazione del DNA

L’elettroforesi su gel è anche uno strumento molto utile per purificare uno specifico frammento di DNA, in questo caso per facilitare il recupero si usa un colorante che permette una visualizzazione maggiore. Esistono diversi tipi di coloranti anche se quello più utilizzato è l’etidio bromuro, questa è una molecola planare che si inserisce tra le basi impilate del DNA a doppio filamento, queste molecole emettono luce fluorescente quando sono irradiati con luce ultravioletta (300 nm). L’etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15 %), o alternativamente dopo l’elettroforesi. Esistono altri tipi di coloranti: colorazione con argento, blu cresile brillante, blu di metilene.

Gel all'1% di agarosio prima di essere esposto a luce UV

Gel esposto a luce ultravioletta, il bromuro di etidio legato al DNA emana luce fluorescente arancione

Frammenti Di DNA separati tramite elettroforesi su gel, colorati con etidio bromuro ed esposti a luce ultravioletta