Colorazione di Gram

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La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che dà ragione della classificazione dei batteri in Gram-positivi e Gram-negativi (anche indicati come Gram+ e Gram−).
Fu messa a punto nel 1884 dal medico danese Hans Joachim Christian Gram, e mette in evidenza alcune proprietà fondamentali della parete cellulare dei microrganismi.

Con tale metodo è possibile esaminare sia batteri in coltura sia frammenti di tessuti.

Significato biologico della colorazione[modifica | modifica wikitesto]

Colonia di Bacillus cereus (Gram +)
Colonia di Escherichia coli (Gram −)

La differenza nella capacità di trattenere il colorante basico è data dalla quantità di peptidoglicano (mureina) contenuto nella parete cellulare: i Gram-positivi presentano amminozuccheri N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico, ai quali sono legate corte catene di amminoacidi, che conferiscono stabilità e consistenza a tale strato; i Gram-negativi presentano invece una parete più sottile, ricca di lipopolisaccaridi e lipoproteine.

Procedura[modifica | modifica wikitesto]

1. Mettere una goccia di acqua sul vetrino portaoggetti.

2. Sterilizzare l'ansa e con essa prelevare il microrganismo da una piastra .

3. Stendere il microrganismo prelevato dalla colonia sulla goccia.

4. Aspettare che si asciughi.

5. Fissare sul vetrino passandolo sul bunsen in modo che aderisca per bene.

6. Predisporre una vaschetta per colorazione e appoggiare i vetrini su un supporto orizzontale oppure mantenere orizzontale il vetrino portaoggetti con l'aiuto di una pinza porta vetrini.

7. Ricoprire il preparato con cristal-violetto che colora le componenti acide (cioè il DNA) e lasciar agire per un minuto.

8. Versare l'eccesso di colorante e sciacquare con acqua; a questo punto i batteri Gram- verranno decolorati, mentre i Gram+ resistono all'azione del solvente e rimangono viola.

9. Ricoprire con il liquido di Lugol che funge da mordenzante. Lasciar agire per un minuto. Far scivolare l'eccesso di Lugol lavando con etanolo e decolorare per un tempo variabile tra 30 e 60 secondi, fino a che il preparato non lascia più il colore.

10. Contrastare con safranina per un minuto. Questo colora le componenti acide rimaste libere dei Gram- e li colora in rosso, mentre non può legarsi ai componenti molecolari dei Gram+, impegnati nel legame con il cristal-violetto. Sciacquare con acqua, sgocciolare il vetrino e lasciarlo asciugare all'aria o passandolo sul bunsen.

11. Osservare al microscopio ottico dapprima a basso ingrandimento e poi con obiettivo a immersione. Come risultato finale si avrà i batteri Gram+ di colore viola, mentre i batteri Gram- di colore rosso.

Le colture batteriche molto vecchie tendono a trattenere meno il colorante, apparendo meno Gram-positive di quanto siano in realtà; alcune (poche) specie di batteri inoltre non danno un responso chiaro alla colorazione, e sono dette Gram-variabili.

La colorazione di Gram è una colorazione di tipo regressivo in quanto, dopo una prima colorazione generale con violetto di nicole o di genziana, avverrà una decolorazione dei batteri Gram− con dell'alcool etilico puro, per poi essere ricolorati utilizzando della safranina.

Colorazione di Gram di alcuni microrganismi comuni[modifica | modifica wikitesto]

Famiglia Gram Aspetto Informazioni Rappresentanti
Micrococchi + cocchi a grappoli, ammassi nelle salamoie, utili per la stagionatura degli alimenti
Stafilococchi + cocchi a grappoli, cubi (sarcine) patogeni nel latte e derivati. Producono tossine. Staphylococcus aureus
Bacilli + bastoncelli provocano alterazioni in molti alimenti. Responsabili del carbonchio. Bacillus anthracis
Clostridium + bastoncelli provocano putrefazione e producono tossine negli scatolami Clostridium tetani, Clostridium botulinum
Batteri propionici (Corynebacteriaceae) + bastoncelli danno le occhiature a formaggi come l'emmental o il grana
Micobatteri + bastoncelli possono provocare la tubercolosi o la lebbra Mycobacterium tubercolosis
Brucella bastoncelli sulla pelle e nelle mucose
Enterobatteri bastoncelli possono provocare diverse patologie a partenza gastro-intestinale. Escherichia coli
Pseudomonas bastoncelli patogeni, nell'acqua e nel suolo Pseudomonas aeruginosa
Aeromonas bastoncelli patogeni, nell'acqua e nel suolo
Ralstonia metallidurans bacilli sopravvivono anche in presenza di metalli pesanti

Batteri Gram negativi[modifica | modifica wikitesto]

Exquisite-kfind.png Lo stesso argomento in dettaglio: Batteri Gram-negativi.

La parete delle cellule dei batteri Gram negativi è molto complessa, la membrana esterna si trova al di fuori dello strato di peptidoglicano, e la proteina presente in maggior quantità è la lipoproteina di Brown, che presenta una terminazione idrofobica tramite la quale si lega alla membrana esterna. In questo modo la lipoproteina funge da legante fra la membrana esterna e lo strato di peptidoglicano. La membrana esterna presenta molte molecole grosse e complesse, denominate “lipopolisaccaridi (LPS)” suddivisi in tre complessi distinti:

  • La regione del lipide A: costituita da un disaccaride con attaccati a ciascun carboidrato tre acidi grassi e fosfato, una cui parte si proietta dalla superficie verso l'esterno, mentre il resto del complesso è ancorato alla membrana esterna.
  • Il nucleo polisaccaridico (o core): costituito da una catena di 10 zuccheri, è legato al lipide A. Esso contiene in genere zuccheri e fosfati caricati elettricamente, perciò contribuisce a rendere negativa la carica della superficie batterica.
  • La catena laterale O, o antigene O: costituito da una corta catena polisaccaridica che si proietta dal nucleo verso l'esterno; a seconda del ceppo batterico varia la sua composizione.

Gli anticorpi della cellula ospite sono in grado di riconoscere le catene laterali O, ma i batteri Gram negativi sono in grado di modificare la natura delle catene laterali in modo da contrastare le difese dell'ospite.

Questo tipo di batteri è più resistente agli antibiotici perché nel periplasma sono presenti enzimi come la beta-lattamasi che distrugge l'anello beta-lattamico di alcuni antibiotici tra cui la penicillina.

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