Utente:SilviaLG6/Sandbox

SINTESI PEPTIDICA

In chimica organica, con sintesi peptidica si intende la produzione di peptidi, in cui più amminoacidi sono collegati mediante legami amminici, noti anche come legami peptidici. I peptidi sono chimicamente sintetizzati dalla reazione di condensazione del gruppo carbossilico di un amminoacido al gruppo amminico di un altro. Solitamente, per prevenire reazioni collaterali indesiderate con le varie catene amminoacidiche laterali, sono necessarie delle strategie di prevenzione. Generalmente, la sintesi chimica dei peptidi ha inizio nell'estremità carbossilica del peptide (C-terminale) e procede in direzione dell'ammio-terminale (N-terminale). La biosintesi proteica (peptidi lunghi) negli organismi viventi avviene invece nella direzione opposta. La sintesi chimica dei peptidi può essere eseguita utilizzando le classiche tecniche in fase di soluzione, sebbene queste siano state sostituite nella maggior parte delle impostazioni di ricerca e sviluppo con metodi in fase solida (vedi sotto). Inoltre, la sintesi in fase di soluzione conserva la sua utilità nella produzione su larga scala di peptidi per scopi industriali. La sintesi chimica facilita la produzione di peptidi che sono difficili da esprimere in batteri, l'incorporazione di aminoacidi non naturali, la modifica della spina dorsale dei peptidi/proteine e la sintesi delle proteine D, ovvero in Aminoacidi D.

Sintesi in fase solida Il metodo stabilito per la produzione di peptidi sintetici in laboratorio è noto come sintesi peptidica in fase solida (SPPS).[ 2] Scoperta da Robert Bruce Merrifield, SPPS consente il rapido assemblaggio di una catena peptidica attraverso reazioni successive di derivati aminoacidici su un supporto di resina di perline gonfiato con solvente macroscopicamente insolubile.

Il supporto solido è costituito da piccole perle di resina polimerica rese funzionali da gruppi reattivi (quali gruppi amminici o idrossili) che si collegano alla nascente catena peptidica. Poiché durante tutta la sintesi il peptide rimane legato covalentemente al supporto, i reagenti in eccesso e i prodotti collaterali possono essere rimossi mediante lavaggio e filtrazione. Questo approccio aggira l'isolamento dispendioso in termini di tempo del peptide prodotto dalla soluzione dopo ogni fase di reazione, che sarebbe necessario nel momento in cui si utilizza la sintesi convenzionale in fase di soluzione.

Ogni amminoacido da accoppiare alla catena peptidica N-terminale deve essere protetto sul suo N-terminale e sulla catena laterale utilizzando gruppi protettivi appropriati come Boc (acido-labile) o Fmoc (base-labile), a seconda della catena laterale e della strategia di protezione utilizzata (vedi sotto).

La procedura generale SPPS è una delle procedure di cicli ripetuti di reazioni alternative di deprotezione N-terminale e reazioni di accoppiamento. La resina può essere lavata tra un passo e l'altro. Inizialmente, un amminoacido è accoppiato alla resina. Successivamente, l'ammina viene deprotetta e quindi accoppiata con il gruppo carbossilico attivato dell'amminoacido successivo da aggiungere. Questo ciclo viene ripetuto fino a quando la sequenza desiderata non è stata sintetizzata. I cicli SPPS possono anche includere passaggi di tappatura che impediscono alle estremità degli aminoacidi che non hanno reagito di reagire. Alla fine della sintesi, il peptide grezzo viene scisso dal supporto solido mentre contemporaneamente rimuove tutti i gruppi protettivi usando un reagente come l'acido trifluoroacetico. Il peptide grezzo può essere precipitato da un solvente non polare come l'etere dietilico per rimuovere i sottoprodotti organici solubili. Il peptide grezzo può essere purificato utilizzando HPLC in fase inversa. Il processo di purificazione, specialmente dei peptidi più lunghi, può essere impegnativo dal momento che le quantità cumulative di numerosi sottoprodotti minori, che hanno proprietà simili al prodotto peptidico desiderato, devono essere rimosse. Per questo motivo i cosiddetti processi di cromatografia continua come MCSGP vengono sempre più utilizzati in ambienti commerciali per massimizzare la resa senza sacrificare la purezza.

L'SPPS è limitato dai rendimenti di reazione a causa dell'accumulo esponenziale di sottoprodotti, e solitamente peptidi e proteine nell'intervallo di 70 aminoacidi stanno spingendo i limiti dell'accessibilità sintetica. Anche la difficoltà sintetica dipende dalla sequenza; in genere le sequenze soggette all'aggregazione come gli amiloidi sono difficili da fare. È possibile accedere a lunghezze più lunghe utilizzando approcci di legatura come la legatura chimica nativa, dove due peptidi sintetici completamente deprotetti più corti possono essere uniti in soluzione.

Reagenti di accoppiamento peptidico Una caratteristica importante che ha permesso l'ampia applicazione dell'SPPS è la generazione di rendimenti estremamente elevati nella fase di accoppiamento. Sono richieste condizioni di formazione di legami ammidici altamente efficienti. Per illustrare l'impatto delle rese di accoppiamento non ottimali per una data sintesi, si consideri il caso in cui ogni fase di accoppiamento dovesse avere almeno il 99% di resa: ciò si tradurrebbe in una resa grezza complessiva del 77% per un peptide di 26-amminoacido (assumendo una resa del 100% in ogni deprotezione); se ogni accoppiamento fosse efficiente al 95%, la resa complessiva sarebbe del 25% e aggiungendo un eccesso di ciascun amminoacido (tra 2 e 10 volte). La minimizzazione della racemizzazione degli aminoacidi durante l'accoppiamento è anche di vitale importanza per evitare l'epimerizzazione nel prodotto peptidico finale. La formazione del legame ammidico tra un'ammina e l'acido carbossilico è lenta e come tale di solito richiede "reagente di accoppiamento" o "attivatori". Esiste una vasta gamma di reagenti di accoppiamento, in parte a data la loro varia efficacia per particolari accoppiamenti, molti di questi reagenti sono disponibili in commercio.

Carbodiimmidi

Le carbodiimmidi, come la dicicloesilcarbodiimmide (DCC) e la diisopropilcarbodiimmide (DIC), sono spesso utilizzate per la formazione di legami ammidici. La reazione procede attraverso la formazione di una O-acilisourea altamente reattiva. Questo intermedio reattivo viene attaccato dall'ammina peptide N-terminale, formando un legame peptidico. La formazione dell'O-acilisourea procede più velocemente in solventi non polari come il diclorometano. DIC è particolarmente utile per SPPS poiché come liquido è facilmente dispensato e il sottoprodotto dell'urea è facilmente lavato via. Al contrario, la relativa carbodiimmide 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (EDC) viene spesso utilizzata per gli accoppiamenti peptidici in fase di soluzione poiché il suo sottoprodotto urea può essere rimosso mediante lavaggio durante la lavorazione acquosa. L'attivazione della carbodiimmide apre la possibilità alla racemizzazione dell'amminoacido attivato. La racemizzazione può essere aggirata con additivi "soppressione della racemizzazione" come i triazoli 1-idrossi-benzotriazolo (HOBt) e 1-idrossi-7-aza-benzotriazolo (HOAt). Questi reagenti attaccano l'intermedio O-acilisourea per formare un estere attivo, che successivamente reagisce con il peptide per formare il legame peptidico desiderato. L'etilcianoidrossiimminoacetato (Oxyma), un additivo per l'accoppiamento carbodiimmide, agisce come alternativa all'HOAt.

Sali di amminio/uronio e fosfonio

Alcuni reagenti di coppia omettono completamente la carbodiimmide e incorporano la frazione HOAt/HOBt come sale di amminio/uronio o fosfonio di un anione non nucleofilo (tetrafluoroborato o esafluorofosfato). Esempi di reagenti amminio/uronio includono HATU (HOAt), HBTU/TBTU (HOBt) e HCTU (6-ClHOBt). HBTU e TBTU differiscono solo nella scelta dell'anione. I reagenti al fosfonio includono PyBOP (HOBt) e PyAOP (HOAt). Questi reagenti formano la stessa specie di estere attivo delle condizioni di attivazione della carbodiimmide, ma differiscono nella velocità della fase di attivazione iniziale, che è determinata dalla natura dello scheletro di carbonio del reagente di accoppiamento. Inoltre, i reagenti amminio/uronio sono in grado di reagire con il peptide N-terminale per formare un sottoprodotto guanidino inattivo, mentre i reagenti fosfonio non lo sono.

Anidride dell'acido propanofosfonico[modifica sorgente] Dalla fine degli anni 2000, l'anidride dell'acido propanofosfonico, venduta commercialmente con vari nomi come "T3P", è diventata un utile reagente per la formazione di legami ammidici nelle applicazioni commerciali. Converte l'ossigeno dell'acido carbossilico in un gruppo uscente, i cui sottoprodotti di accoppiamento peptidico sono solubili in acqua e possono essere facilmente lavati via. In un confronto delle prestazioni tra l'anidride dell'acido propanofosfonico e altri reagenti di accoppiamento peptidico per la preparazione di un farmaco non apeptidico, è stato riscontrato che questo reagente era superiore ad altri reagenti per quanto riguarda la resa e la bassa epimerizzazione.[18]

Supporti solidi I supporti solidi per la sintesi dei peptidi sono selezionati per la stabilità fisica, per consentire la rapida filtrazione dei liquidi. I supporti adatti sono inerti ai reagenti e ai solventi utilizzati durante la SPPS e consentono l'attacco del primo amminoacido. Il rigonfiamento è di grande importanza dal momento che la sintesi dei peptidi avviene all'interno dei pori rigonfi del supporto solido. Tre tipi principali di supporti solidi sono: supporti di tipo gel, supporti di tipo superficiale e compositi. I miglioramenti apportati ai supporti solidi utilizzati per la sintesi dei peptidi migliorano la loro capacità di resistere all'uso ripetuto di TFA durante la fase di deprotezione di SPPS. Vengono utilizzate due resine primarie, a seconda che si desideri un acido carbossilico C-terminale o un'ammide. La resina Wang era, a partire dal 1996, la resina più comunemente usata per i peptidi con acidi carbossilici C-terminali.

Schemi di protezione dei gruppi

Come descritto sopra, l'uso di gruppi protettivi della catena N-terminale e laterale è essenziale durante la sintesi del peptide per evitare reazioni collaterali indesiderate, come l'autoaccoppiamento dell'amminoacido attivato che porta alla (polimerizzazione). Ciò competerebbe con la prevista reazione di accoppiamento del peptide, con conseguente bassa resa o addirittura completa incapacità di sintetizzare il peptide desiderato. Nella sintesi di peptidi in fase solida vengono tipicamente utilizzati due schemi di gruppi protettivi principali: i cosiddetti approcci Boc/benzile e Fmoc/terz.butile. La strategia Boc/Bzl utilizza la protezione Boc N-terminale TFA-labile insieme alla protezione della catena laterale che viene rimossa utilizzando acido fluoridrico anidro durante la fase di scissione finale (con scissione simultanea del peptide dal supporto solido). Fmoc/tBu SPPS utilizza una protezione N-terminale Fmoc labile alla base, con protezione della catena laterale e un legame di resina che sono acido-labili (la scissione acida finale viene effettuata tramite trattamento con TFA). Entrambi gli approcci, inclusi i vantaggi e gli svantaggi di ciascuno, sono descritti più dettagliatamente di seguito.

Boc/Bzl SPPS Articolo principale: gruppo protettivo terz-butilossicarbonile

Prima dell'avvento dell'SPPS, i metodi in soluzione per la sintesi chimica dei peptidi si basavano sul tert-butilossicarbonile (abbreviato "Boc") come gruppo protettivo α-amminico N-terminale temporaneo. Il gruppo Boc viene rimosso con acido, come l'acido trifluoroacetico (TFA). Questo forma un gruppo amminico caricato positivamente in presenza di un eccesso di TFA (si noti che il gruppo amminico non è protonato nell'immagine a destra), che viene neutralizzato e accoppiato all'amminoacido attivato in arrivo. La neutralizzazione può avvenire prima dell'accoppiamento o in situ durante la reazione di accoppiamento di base. L'approccio Boc/Bzl mantiene la sua utilità nel ridurre l'aggregazione del peptide durante la sintesi. Inoltre, Boc/benzyl SPPS può essere preferito rispetto all'approccio Fmoc/tert.butyl quando si sintetizzano peptidi contenenti frazioni sensibili alla base (come depsipeptidi o frazioni tioestere), poiché è richiesto il trattamento con base durante la fase di deprotezione Fmoc (vedi sotto). I gruppi protettivi permanenti della catena laterale usati durante Boc/benzyl SPPS sono tipicamente benzilici o gruppi a base benzilica. La rimozione finale del peptide dal supporto solido avviene contemporaneamente alla deprotezione della catena laterale utilizzando acido fluoridrico anidro tramite scissione idrolitica. Il prodotto finale è un sale fluoruro relativamente facile da solubilizzare. Gli scavenger come il cresolo devono essere aggiunti all'HF per evitare che i cationi reattivi generino sottoprodotti indesiderati.

Fmoc/tBu SPPS Vedi anche: gruppo protettivo fluorenilmetilossicarbonile

L'uso della protezione Fmoc N-terminale consente uno schema di deprotezione più blando rispetto a quello utilizzato per Boc/Bzl SPPS, e questo schema di protezione è veramente ortogonale in condizioni SPPS. La deprotezione Fmoc utilizza una base, tipicamente il 20-50% di piperidina nel DMF. L'ammina esposta è quindi neutra e di conseguenza non è richiesta alcuna neutralizzazione della resina peptidica, come nel caso dell'approccio Boc/Bzl. Tuttavia, la mancanza di repulsione elettrostatica tra le catene peptidiche può comportare un aumento del rischio di aggregazione con Fmoc/tBu SPPS. Poiché il gruppo fluorenilico liberato è un cromoforo, la deprotezione Fmoc può essere monitorata mediante assorbanza UV della miscela di reazione, una strategia impiegata nei sintetizzatori peptidici automatizzati. La capacità del gruppo Fmoc di essere scisso in condizioni basiche relativamente blande pur essendo stabile all'acido consente l'uso di gruppi protettivi della catena laterale come Boc e tBu che possono essere rimossi in condizioni di scissione finale (TFA) acide più miti rispetto a quelle utilizzate per la scissione finale scissione in Boc/Bzl SPPS (HF). Gli scavenger come l'acqua e il triisopropilsilano (TIPS) vengono aggiunti più comunemente durante la scissione finale per prevenire reazioni collaterali con specie cationiche reattive rilasciate come risultato della deprotezione della catena laterale. Tuttavia, potrebbero essere utilizzati anche molti altri composti scavenger. Il peptide grezzo risultante è ottenuto come sale TFA, che è potenzialmente più difficile da solubilizzare rispetto ai sali di fluoruro generati in Boc SPPS. Fmoc/tBu SPPS è meno economico atomicamente, poiché il gruppo fluorenilico è molto più grande del gruppo Boc. Di conseguenza, i prezzi degli amminoacidi Fmoc erano alti fino a quando negli anni '90 iniziò la sperimentazione su larga scala di uno dei primi farmaci peptidici sintetizzati, l'enfuvirtide, quando la domanda del mercato aggiustò i prezzi relativi degli amminoacidi Fmoc- vs Boca-.

Altri gruppi protettivi

Benzilossi-carbonile Vedi anche: carbossibenzile Il gruppo (Z) è un altro gruppo protettivo amminico di tipo carbammato, scoperto da Leonidas Zervas all'inizio degli anni '30 e solitamente aggiunto tramite reazione con benzil cloroformiato. Viene rimosso in condizioni difficili utilizzando HBr in acido acetico o condizioni più lievi di idrogenazione catalitica. Questa metodologia è stata utilizzata per la prima volta nella sintesi di oligopeptidi da Zervas e Max Bergmann nel 1932. Quindi, questa divenne nota come la sintesi di Bergmann-Zervas, che fu caratterizzata come "creazione di epoche" e aiutò a stabilire la chimica dei peptidi sintetici come un campo distinto. Ha costituito il primo metodo di laboratorio utile per la sintesi controllata di peptidi, consentendo la sintesi di peptidi precedentemente irraggiungibili con catene laterali reattive, mentre gli amminoacidi Z protetti sono anche prevenuti dalla racemizzazione. L'uso del metodo Bergmann-Zervas è rimasto la pratica standard nella chimica dei peptidi per due interi decenni dopo la sua pubblicazione, sostituito da metodi più recenti (come il gruppo di protezione Boc) nei primi anni '50. Al giorno d'oggi, mentre è stato usato periodicamente per la protezione dell'α-ammina, è molto più comunemente usato per la protezione della catena laterale.

Alloc e gruppi vari Il gruppo protettivo allilossicarbonile (alloc) viene talvolta utilizzato per proteggere un gruppo amminico (o acido carbossilico o gruppo alcolico) quando è richiesto uno schema di deprotezione ortogonale. A volte viene anche utilizzato durante la formazione di peptidi ciclici sulla resina, in cui il peptide è collegato alla resina da un gruppo funzionale della catena laterale. Il gruppo Alloc può essere rimosso usando tetrakis(trifenilfosfina)palladio(0).

Per applicazioni speciali come fasi sintetiche che coinvolgono microarray proteici, vengono utilizzati gruppi protettivi talvolta definiti "litografici", che sono suscettibili di fotochimica a una particolare lunghezza d'onda della luce, e quindi che possono essere rimossi durante operazioni di tipo litografico.

Formazione del legame disolfuro regioselettivo La formazione di più disolfuri nativi rimane una sfida per la sintesi di peptidi nativi con metodi in fase solida. La combinazione casuale di catene si traduce in genere in diversi prodotti con legami disolfuro non nativi. La formazione graduale di legami disolfuro è tipicamente il metodo preferito ed è eseguita con gruppi protettivi tiolici. Diversi gruppi di protezione tiolica forniscono molteplici dimensioni di protezione ortogonale. Queste cisteine ​​ortogonalmente protette sono incorporate durante la sintesi in fase solida del peptide. La successiva rimozione di questi gruppi, per consentire l'esposizione selettiva dei gruppi tiolici liberi, porta alla formazione di disolfuro in modo graduale. L'ordine di rimozione dei gruppi deve essere considerato in modo che venga rimosso un solo gruppo alla volta. I gruppi protettivi tiolici utilizzati nella sintesi peptidica che richiedono la successiva formazione di legami disolfuro regioselettivi devono possedere molteplici caratteristiche. In primo luogo, devono essere reversibili con condizioni che non influenzino le catene laterali non protette. In secondo luogo, il gruppo protettore deve essere in grado di resistere alle condizioni della sintesi in fase solida. In terzo luogo, la rimozione del gruppo protettivo tiolico deve essere tale da lasciare intatti altri gruppi protettivi tiolici, se si desidera una protezione ortogonale. Cioè, la rimozione di PG A non dovrebbe influenzare PG B. Alcuni dei gruppi protettivi tiolici comunemente usati includono acetamidometil (Acm), terz-butile (But), 3-nitro-2-piridina sulfenil (NPYS), 2- gruppi piridina-sulfenile (Pyr) e tritile (Trt). È importante sottolineare che il gruppo NPYS può sostituire l'Acm PG per produrre un tiolo attivato. Utilizzando questo metodo, Kiso e colleghi hanno riportato la prima sintesi totale di insulina nel 1993. In questo lavoro, la catena A dell'insulina è stata preparata con i seguenti gruppi protettivi presenti sulle sue cisteine: CysA6(But), CysA7(Acm) e CysA11(But), lasciando CysA20 non protetto.

Sintesi peptidica assistita da microonde Vedi anche: chimica a microonde La sintesi peptidica assistita da microonde è stata utilizzata per completare lunghe sequenze peptidiche con alti gradi di resa e bassi gradi di racemizzazione.

Peptidi ciclici Sulla ciclizzazione della resina I peptidi possono essere ciclizzati su un supporto solido. È possibile utilizzare una varietà di reagenti di ciclizzazione come HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA, PyClock/DIEA. I peptidi testa-coda possono essere realizzati sul supporto solido. La deprotezione del C-terminale in un punto adatto consente la ciclizzazione su resina mediante formazione di legami ammidici con l'N-terminale deprotetto. Una volta avvenuta la ciclizzazione, il peptide viene separato dalla resina mediante acidolisi e purificato.

La strategia per la sintesi in fase solida dei peptidi ciclici non è limitata all'attaccamento attraverso le catene laterali Asp, Glu o Lys. La cisteina ha un gruppo sulfidrilico molto reattivo sulla sua catena laterale. Un ponte disolfuro si crea quando un atomo di zolfo di una cisteina forma un singolo legame covalente con un altro atomo di zolfo di una seconda cisteina in una parte diversa della proteina. Questi ponti aiutano a stabilizzare le proteine, specialmente quelle secrete dalle cellule. Alcuni ricercatori usano cisteine ​​modificate utilizzando S-acetomidometil (Acm) per bloccare la formazione del legame disolfuro ma preservare la cisteina e la struttura primaria originale della proteina.

Ciclizzazione fuori resina La ciclizzazione fuori resina è una sintesi in fase solida di intermedi chiave, seguita dalla ciclizzazione chiave in fase di soluzione, anche la deprotezione finale di eventuali catene laterali mascherate viene eseguita in fase di soluzione. Ciò presenta gli svantaggi che le efficienze della sintesi in fase solida vengono perse nelle fasi della fase di soluzione, che è necessaria la purificazione da sottoprodotti, reagenti e materiale non convertito e che si possono formare oligomeri indesiderati se è coinvolta la formazione di macrocicli.

L'uso di pentafluorofenil esteri (FDPP, PFPOH) e BOP-Cl sono utili per la ciclizzazione dei peptidi.

Storia Il primo peptide protetto fu sintetizzato da '''Theodor Curtius''' nel 1882 e il primo peptide libero fu sintetizzato da '''Emil Fischer''' nel 1901.