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ChIP-sequencing workflow

La Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) è un tipo di tecnica sperimentale di immunoprecipitation usata per identificare le interazioni tra proteins e DNA all'interno della cellula. Questa tecnica mira a determinare se specifiche proteine siano associate con specifiche regioni genomiche, come transcription factors su promoters o altri DNA binding sites, e se possibile definire i cistromes. La ChIP inoltre cerca di determinare i punti del genoma specifici delle varie modificazioni degli histone, indicando il bersaglio dei modificatori degli istoni.[1]

Brevemente, il metodo si sviluppa in questa maniera: la proteina e la chromatin a cui è associata vengono temporaneamente fatte legare in un cell lysate, quindi i complessi DNA-proteina (cromatina-proteina) vengono tagliati e i frammenti di DNA associati alla proteina d'interesse vengono immunoprecipitati selettivamente, dopodichè i frammenti di DNA vengono purificati dalle proteine e sequenziati. Le sequenze di DNA identificate sono probabilmente quelle associate con la proteina d'interesse in vivo.

ChIP classica[modifica | modifica wikitesto]

Ci sono due tipi di ChIP, che differiscono principalmente nel tipo di cromatina utilizzata come materiale di partenza. Un tipo utilizza cromatina "cross-linked" in maniera reversibile e frammentata tramite sonicazione, e viene chiamato cross-linked ChIP (XChIP). La native ChIP (NChIP) usa la cromatina in forma nativa frammentata mediante digestione con nucleasi micrococciche.

Cross-linked ChIP (XChIP)[modifica | modifica wikitesto]

La cross-linked ChIP è principalmente utilizzata per localizzare siti di legame sul DNA di fattori di trascrizione o altre proteine associate al DNA, e usa cromatina "cross-linked" come materiale di partenza. L'agente usato per il cross-linking reversibile può essere formaldehyde[2] o UV light.[3] Quindi la cromatina cross-linked viene di solito frammentata tramite sonicazione, creando frammenti di circa 300-1000 pb di lunghezza.[4] I frammenti di cromatina di 400-500pb possono essere utilizzati per saggi ChIP e coprono da 2 a 3 nucleosomi.

I detriti cellulari nel lisato vengono eliminati per sedimentazione e i complessi proteine DNA vengono immunoprecipitati selettivamente usando anticorpi specifici per la proteina d'interesse. Gli anticorpi sono di solito coniugati con agarose, sepharose o magnetic beads. I complessi immunoprecipitati (cioè il complesso bead-anticorpo-proteina-sequenza target di DNA) vengono poi raccolti e lavati per rimuovere la cromatina legata in maniera aspecifica, quindi il cross-link proteina-DNA viene rotto e le proteine vengono rimosse tramite digestione con proteinase K.

Il DNA associato con il complesso viene poi purificato e identificato tramite polymerase chain reaction (PCR), microarrays (ChIP-on-chip), clonaggio e sequenziamento, o sequenziamento diretto ad alto rendimento (ChIP-Seq).

Native ChIP (NChIP)[modifica | modifica wikitesto]

La Native ChIP viene utilizzata principalmente per mappare le sequenze di DNA bersaglio dei modificatori degli histone. Di solito, come materiale di partenza si usa la cromatina nativa, in quanto gli istoni si avvolgono naturalmente intorno alla cromatina, formando i nucleosomi. Quindi la cromatina viene frammentata tramite digestione con nucleasi micrococciche, in modo da tagliare il DNA a livello del DNA linker, per lasciare i nucleosomi intatti e fornire frammenti di DNA comprendendi da uno (200pb) a cinque (1000pb) nucleosomi.

In seguito, metodi simili a quelli utilizzati per l'XChIP vengono sfruttati per allontanare i detriti cellulari, immunoprecipitare la proteina d'interesse, rimuovere la proteina dal complesso immunoprecipitato e purificare ed analizzare il DNA isolato.

Comparison of XChIP and NChIP[modifica | modifica wikitesto]

Il maggiore vantaggio della NChIP è la specificità degli antibody. È importante notare che la maggior parte degli anticorpi verso istoni modificati viene creata contro antigeni peptidici sintetici e gli epitope che devono riconoscere nell'XChIP possono essere distrutti o interrotti dal cross-linking mediante formaldeide, in particolare in quanto i cross-link possono coinvolgere residui di lysine nei gruppi N-terminali, che interrompono gli epitopi. Questo può spiegare l'efficienza molto bassa dei protocolli di XChIP rispetto a quelli di NChIP.

Ma XChIP e NChIP hanno diversi obiettivi e vantaggi uno rispetto all'altro, l'XChIP è usata per mappare siti bersaglio di fattori di trascrizione e altre proteine associate alla cromatina, mentre NChIP è usata per mappare siti bersaglio dei modificatori degli istoni (vedi Tabella 1).

Tabella 1 Vantaggi e svantaggi di NChIP e XChIP

XChIP NChIP
Vantaggi Utilizzabile per fattori di trascrizione, o qualsiasi altra proteina debolmente associata alla cromatina.
Applicabile a qualsiasi organismo in cui le proteine native sono difficili da preparare 		Specificità degli anticorpi saggiabile
Specificità degli anticorpi più elevata

Maggiore efficienza di recupero di cromatina e proteine grazie alla maggiore specificità degli anticorpi

Svantaggi Inefficient chromatin recovery due to antibody target protein epitope disruption
May cause false positive result due to fixation of transient proteins to chromatin
Wide range of chromatin shearing size due to random cut by sonication. 		Usually not suitable for non-histone proteins
Nucleosomes may rearrange during digestion

History and New ChIP methods[modifica | modifica wikitesto]

In 1984 John T. Lis and David Gilmour, at the time a graduate student in his lab, utilized UV irradiation to covalently cross-link proteins in contact with neighboring DNA in intact living bacterial cells. following lysis of cross-linked cells and immunoprecipitation of bacterial RNA polymerase, DNA associated with enriched RNA polymerase was hybridized to probes corresponding to different regions of known genes to determine the in vivo distribution and density of RNA polymerase at these genes. A year later they used the same methodology to study distribution of eukaryotic RNA polymerase II on fruit fly heat shock genes. These reports could perhaps be considered the pioneering work in the field of chromatin immunoprecipitation[5][6]. XChIP was further modified and developed by Alexander Varshavsky and co-workers ,where they examined distribution of histone H4 on heat shock genes using formaldehyde cross-linking[7][8]. This technique has been extensively developed and refined thereafter.[9] NChIP approach was first described by Hebbes et al., 1988,[10] and also been developed and refined quickly.[11] The typical ChIP assay usually take 4–5 days, and require 106~ 107 cells at least. Now new techniques on ChIP could be achieved as few as 100~1000 cells and complete within one day.

  • Carrier ChIP (CChIP): This approach could use as few as 100 cells by adding Drosophila cells as carrier chromatin to reduce loss and facilitate precipitation of the target chromatin. However, it demands highly specific primers for detection of the target cell chromatin from the foreign carrier chromatin background, and it takes two to three days.[12]
  • Fast ChIP (qChIP): The fast ChIP assay reduced the time by shortening two steps in a typical ChIP assay: (i) an ultrasonic bath accelerates the rate of antibody binding to target proteins—and thereby reduces immunoprecipitation time (ii) a resin-based (Chelex-100) DNA isolation procedure reduces the time of cross-link reversal and DNA isolation. However, the fast protocol is suitable only for large cell samples (in the range of 106~107).[13][14] Up to 24 sheared chromatin samples can be processed to yield PCR-ready DNA in 5 hours, allowing multiple chromatin factors be probed simultaneously and/or looking at genomic events over several time points.[15]
  • Quick and quantitative ChIP (Q2ChIP) : The assay uses 100,000 cells as starting material and is suitable for up to 1,000 histone ChIPs or 100 transcription factor ChIPs. Thus many chromatin samples can be prepared in parallel and stored, and Q2ChIP can be undertaken in a day.[16]
  • MicroChIP (µChIP): chromatin is usually prepared from 1,000 cells and up to 8 ChIPs can be done in parallel without carriers. The assay can also start with 100 cells, but only suit for one ChIP. It can also use small (1 mm3) tissue biopsies and microChIP can be done within one day.[17][18]
  • Matrix ChIP: This is a microplate-based ChIP assay with increased throughput and simplified the procedure. All steps are done in microplate wells without sample transfers, enabling a potential for automation. It enables 96 ChIP assays for histone and various DNA-bound proteins in a single day.[19]

ChIP has also been applied for genome wide analysis by combining with microarray technology (ChIP-on-chip) or second generation DNA-sequencing technology (Chip-Sequencing). ChIP can also combine with paired-end tags sequencing in Chromatin Interaction Analysis using Paired End Tag sequencing (ChIA-PET), a technique developed for large-scale, de novo analysis of higher-order chromatin structures.[20][21][22]

See also[modifica | modifica wikitesto]

  • RIP-Chip, a similar technique to analyze RNA-protein interactions
  • DamID, an alternative location mapping technique that does not require specific antibodies

References[modifica | modifica wikitesto]

  1. ^ Collas, Philippe., The Current State of Chromatin Immunoprecipitation, in Molecular Biotechnology, vol. 45, n. 1, January 2010, pp. 87–100, DOI:10.1007/s12033-009-9239-8.
  2. ^ Jackson, Vaughn, Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent, in Cell, vol. 15, n. 3, November 1978, pp. 945–54, DOI:10.1016/0092-8674(78)90278-7. URL consultato il 13 marzo 2010.
  3. ^ Gilmour DS, Lis JT, In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster, in Molecular and Cellular Biology, vol. 5, n. 8, August 1985, pp. 2009–18. URL consultato il 13 marzo 2010.
  4. ^ Bauer UM, Daujat S, Nielsen SJ, Nightingale K, Kouzarides T, Methylation at arginine 17 of histone H3 is linked to gene activation, in EMBO Reports, vol. 3, n. 1, January 2002, pp. 39–44, DOI:10.1093/embo-reports/kvf013. URL consultato il 13 marzo 2010.
  5. ^ [1]
  6. ^ [2]
  7. ^ Varshavsky A, Discovery of cellular regulation by protein degradation, in Journal of Biological Chemistry, vol. 283, n. 50, December 2008, pp. 34469–89, DOI:10.1074/jbc.X800009200. URL consultato il 6 marzo 2010.
  8. ^ Solomon, Mark J; Larsen Pamela L; Varshavsky, Alexander., Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene, in Cell, vol. 53, n. 6, June 1988, pp. 937–47, DOI:10.1016/S0092-8674(88)90469-2. URL consultato il 6 marzo 2010.
  9. ^ Orlando V, Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation, in Trends in Biochemical Sciences, vol. 25, n. 3, March 2000, pp. 99–104, DOI:10.1016/S0968-0004(99)01535-2. URL consultato il 14 marzo 2010.
  10. ^ Hebbes, Tim R; Thorne, Alan W; Crane-Robinson C., A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin, in The EMBO Journal, vol. 7, n. 5, May 1988, pp. 1395–402.
  11. ^ O'Neill, Laura P; Turner, Bryan M, Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP, in Methods (San Diego, Calif.), vol. 31, n. 1, September 2003, pp. 76–82, DOI:10.1016/S1046-2023(03)00090-2. URL consultato il 14 marzo 2010.
  12. ^ O'Neill, Laura P; VerMilyea, Matthew D; Turner, Bryan M, Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations, in Nature Genetics, vol. 38, n. 7, July 2006, pp. 835–41, DOI:10.1038/ng1820. URL consultato il 14 marzo 2010.
  13. ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Sova, Pavel; Bomsztyk, Karol, Fast chromatin immunoprecipitation assay, in Nucleic Acids Research, vol. 34, n. 1, 2006, pp. e2, DOI:10.1093/nar/gnj004. URL consultato il 14 marzo 2010.
  14. ^ Nelson, Joel D; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol, Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method, in Nature Protocols, vol. 1, n. 1, 2006, pp. 179–85, DOI:10.1038/nprot.2006.27. URL consultato il 14 marzo 2010.
  15. ^ Nelson J, Denisenko O, Bomsztyk K, The fast chromatin immunoprecipitation method, in Methods in Molecular Biology, vol. 567, 2009, pp. 45–57, DOI:10.1007/978-1-60327-414-2_3. URL consultato il 14 marzo 2010.
  16. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe, Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells, in Stem Cells, vol. 25, n. 4, April 2007, pp. 1037–46, DOI:10.1634/stemcells.2006-0430. URL consultato il 14 marzo 2010.
  17. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe, A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP), in Nature Protocols, vol. 3, n. 6, 2008, pp. 1032–45, DOI:10.1038/nprot.2008.68. URL consultato il 14 marzo 2010.
  18. ^ Dahl, John Arne; Collas, Philippe, MicroChIP: chromatin immunoprecipitation for small cell numbers, in Methods in Molecular Biology, vol. 567, 2009, pp. 59–74, DOI:10.1007/978-1-60327-414-2_4. URL consultato il 14 marzo 2010.
  19. ^ Flanagin, Steve ; Nelson, Joel D; Castner, David G; Denisenko, Oleg; Bomsztyk, Karol, Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events, in Nucleic Acids Research, vol. 36, n. 3, February 2008, pp. e17, DOI:10.1093/nar/gkn001. URL consultato il 14 marzo 2010.
  20. ^ Fullwood, Melissa J; Han, Yuyuan; Wei, Chia-Lin; Ruan, Xiaoan; Ruan, Yijun, Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing, in Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 21, January 2010, pp. Unit 21.15.1–25, DOI:10.1002/0471142727.mb2115s89. URL consultato il 14 marzo 2010.
  21. ^ Li, Guoliang; Fullwood, Melissa J; Xu, Han; Mulawadi, Fabianus Hendriyan; Velkov, Stoyan; Vega, Vinsensius; Ariyaratne, Pramila Nuwantha; Mohamed, Yusoff Bin; Ooi, Hong-Sain; Tennakoon, Chandana; Wei, Chia-Lin; Ruan, Yijun; Sung, Wing-Kin, ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing, in Genome Biology, vol. 11, n. 2, February 2010, pp. R22, DOI:10.1186/gb-2010-11-2-r22. URL consultato il 14 marzo 2010.
  22. ^ ChIA-PET: Novel Method For 3-D Whole Genome Mapping Research, in ScienceDaily, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore., 8 novembre 2009. URL consultato il 14 March 2010.

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