Protoplasto

Protoplasti ottenuti da cellule di una foglia di petunia

Indica l'unità di protoplasma della cellula e consiste di citoplasma e nucleo. Sostanzialmente è tutto il contenuto del lume cellulare e vi si comprende anche la membrana citoplasmatica.
Il lume cellulare indica lo spazio fisico, il protoplasto indica il contenuto. Il protoplasto è presente nelle cellule vive, ma non in quelle morte: in quest'ultimo caso il lume cellulare non conterrà protoplasto.
L'insieme dei protoplasmi di un organismo vegetale viene detto simplasto.

La parola deriva da protoplasma, termine con cui si indica la materia vivente. La penicillina converte i batteri gram positivi in protoplasti inibendo la sintesi del peptidoglicano presente nella loro parete.

Il citoplasma ed il succo vacuolare sono solitamente ipertonici rispetto all'esterno della cellula: questo crea una pressione osmotica che si traduce con l'ingresso di acqua nel protoplasto.

Come ottenere un Protoplasto

Per ottenere un protoplasto da una cellula vegetale si eseguono normalmente le seguente procedure:

-1)Pre-trattamento (induzione della plasmolisi)

-2)Trattamento enzimatico

-3)Recupero dei protoplasti

-4)Verifica dalle loro purezza, vitalità e dimensione

-5)Calcolo del numero di protoplasti isolati

Pre-trattamento

Si preleva del materiale vegetale (normalmente una foglia) e si prevede alla sua sterilizzazione. La foglia ora sterilizzata viene tagliata in fette o dischi molto sottili e si tratta tale materiale con una soluzione di saccarosio e sorbitolo al 20%. Tale soluzione richiama acqua dalla cellula che quindi si sgonfia poca alla volta. Il pre-trattamento ha lo scopo di aumentare la vitalità dei protoplasti e può essere svolta o prima o durante il trattamento enzimatico. In questo secondo caso la soluzione di saccarosio e sorbitolo verrà aggiunto al mix di enzimi. Per aumentare la vitalità dei protoplasti è necessario partire da tessuti estremamente giovani caratterizzati da un attiva divisione. A questo scopo sono molto tessuti che derivano da colture in vitro di germogli.

Trattamento enzimatico

Il materiale vegetale che ha subito il pre-trattamento viene ora trattato con spazzola, materiale quali carborundum e cutinasi allo scopo di aumentare la resa del trattamento enzimatico. Può rivelarsi anche utile incubare il materiale vegetala al buio, allo scopo di facilitare il distacco dell' epidermide inferiore, sul quale verrà svolto il trattamento enzimatico. Terminate queste operazioni preliminari, si trasferisce quindi l'epidermide inferiore su un substrato contente un mix di enzimi idrolitici ossia cellulasi, emicellulasi e pectinasi. Tali enzimi degraderanno la parete cellulare facendoci ottenere un protoplasto. Tale trattamento viene svolto nelle seguenti condizioni:

-pH del substrato leggermente sub-acido ( 5,5-6,0)

-alla luce o al buio

-a temperature intorno ai 25°C

-addizionando al substrato dei coaudiuvanti come PVP che svolge un azione antiossidante e il solfato destrano di potassio che elimini gli eventuali contaminati derivanti dalla plasmolisi

Recupero dei protoplasti

Terminata la digestione enzimatica si devono recuperare i protoplasti. Essi non saranno isolati, ma si troveranno in contatto con numeroso materiale inquinante ( resti della parete cellulari, organelli, corpi di riserva ecc.), per cui occore precedere al loro isolamento. Per isolarli ci sono numerose procedure:

-Filtrazione

La filtrazione viene svolta usando dei filtri aventi porosità di 100 micrometri. Normalmente tale procedure non ha un alta resa di purificazione, per cui il filtrato viene centrifugato. Da questa centrifugazione si ottiene un supernatante che viene eliminato e un pellet che viene lavato con una soluzione ipotonica e risospeso.

-Flottazione

Si sfrutta la bassa densità per protoplasti per isolarli dal materiale inquinante. Si usano saccarosio e sorbitolo e si centrifuga il tutto ottenendo i protoplasti nella parte alta della provetta. Si possono anche creare gradienti continui o discontinui. In questo caso si usano sostanze ad alto peso molecolare come il polisaccaride Ficoll. In questo caso i protoplasti saranno posizionati tra il polisaccaride e la soluzione zuccherina

Voci correlate

• Sferoplasto