DGGE
In genetica, la DGGE (acronimo di Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) è una tecnica di separazione di acidi nucleici applicata all'identificazione di specie microbiche in ecosistemi complessi[1].
Metodologia[modifica | modifica wikitesto]
Il metodo fu ideato da Fisher e Lerman nel 1983, per l'individuazione di polimorfismi coinvolti in malattie genetiche e poi applicato alla separazione di ampliconi dei geni 16S e 23S rRNA di lunghezza compresa fra 200-700 bp derivati da campioni ambientali.
Dal punto di vista tecnico, la DGGE si basa sulle differenze di comportamento nella denaturazione di frammenti a doppia elica di DNA. Il principio che regola la DGGE è che, durante una corsa elettroforetica su gel di acrilammide contenente un gradiente di agenti denaturanti (in genere urea e formammide), molecole di DNA a doppio filamento di diversa sequenza ma di stesse dimensioni, denaturano e le risultanti molecole ramificate riducono la propria mobilità in punti differenti del gradiente. In particolare, durante l'elettroforesi, il frammento di DNA rimane a doppio filamento finché non raggiunge la zona del gel corrispondente alla sua temperatura di melting (Tm). Essa equivale alla condizione in cui il frammento risulta parzialmente denaturato e pertanto presenta una mobilità elettroforetica ridotta. La completa dissociazione della doppia elica del DNA viene impedita dall'aggiunta all'estremità 5' del primer forward, di una coda formata da circa 40 basi di G+C [2]. La Tm del DNA è influenzata da due fattori:
- i legami a idrogeno formati tra paia di basi complementari, i quali fanno sì che le regioni ricche di G e C fondano ad una temperatura superiore rispetto alle regioni ricche di A e T;
- l'attrazione tra basi adiacenti appartenenti allo stesso profilo.
La DGGE consente quindi di separare frammenti di DNA aventi uguale lunghezza ma che differiscono per la sequenza o per la composizione delle coppie di basi: tali molecole avranno un diverso comportamento di denaturazione e termineranno la loro migrazione nel gel di poliacrilammide, in differenti posizioni [3].
Qualora applicata a barcoding markers amplificati con una coppia di primer universali da un campione ambientale amplificato, la DGGE produce un pattern di bande che è indicativo del numero delle specie microbiche che sono presenti nel campione in esame, dando una stima la diversità microbica in un dato ecosistema [4]. Inoltre sequenziando i frammenti di DNA separati nel gel e comparando le sequenze con quelle presenti nelle banche dati è possibile identificare i microrganismi a livello di specie o ceppo.
Note[modifica | modifica wikitesto]
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