Utente:Puzzlemarco/Sandbox
Sono necessari degli elementi perchè avvenga il processo del clonaggio; questi sono i vettori, che devono presentare caratteristiche specifiche: - replicazione all’interno di un organismo ospite (amplificazione); - contengono regioni non essenziali che possono essere sostituite dalla sequenza di interesse; - contengono regioni che permettono l’inserimento di sequenze (polylinker); - marcatori genici (utili per la selezione); - possono essere facilmente estratti dalla cellula ospite. I vettori principali sono: 1.enzimi di restrizione; 2.plasmidi; 3.cosmidi; 4.batteriofagi; 5.BAC; 6.YAC.
1.Enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono enzimi prodotti dalle cellule batteriche, che hanno lo scopo di tagliare la molecola di DNA in tratti più corti.Il taglio viene effettuato in corrispondenza di alcune sequenze specifiche di basi azotate. Il primo enzima di restrizione scoperto è stato trovato in un ceppo di Escherichia coli: l’ EcoR1: E indica il genere batterico (Escherichia), co la specie (coli), R il ceppo di laboratorio (ceppo RY13), 1 indica il fatto che fu il primo identificato in quel ceppo batterico. Questo enzima di restrizione taglia in corrispondenza della sequenza GGATTC in direzione 3’→ 5’. L’enzima EcoR1 seca i due filamenti di DNA tra la guanina e l’adenina ad essa adiacente, ottenendo così: 3’ G AATTC 5’ 5’ CTTAA G 3’ Otteniamo così una catena con delle “linguette”, una base “G” per ogni filamento come estremità coesiva. in questo punto possiamo inserire il nostro plasmide e grazie alla DNA ligasi i legami peptidici si ripristinano.
2.Plasmidi I plasmidi sono elementi genetici extracromosomici che si replicano autonomamente in cellule batteriche. Normalmente i plasmidi hanno DNA circolare a doppio filamento, anche se esistono dei plasmidi con DNA lineare. All’interno delle cellule di E. coli il DNA plasmidico si trova in una forma caratteristica, in cui il DNA circolare a doppio filamento condensa nello spazio intorno all’asse della doppia elica. Tale struttura viene chiamata “struttura superavvolta” ed è quella presente in natura. I plasmidi utilizzati come vettori di clonaggio sono dei derivati di plasmidi naturali, specializzati per rispondere a ben precisi requisiti: 1) contengono una sequenza, denominata sequenza ori (da origine), che funziona come origine di replicazione del DNA plasmidico nelle cellule batteriche ospiti e che permette, quindi, ai plasmidi di replicarsi come elementi extracromosomici. La replicazione del DNA plasmidico avviene quindi in modo indipendente dalla replicazione del DNA del cromosoma; 2) contengono almeno un marcatore selettivo che permette di distinguere le cellule ospiti che contengono il plasmide da quelle che non lo contengono; ad esempio marcatori selettivi. 3) un buon vettore di clonaggio deve contenere una zona dove è possibile “inserire” il DNA esogeno da clonare. Questa zona, che è chiamata polylinker, o zona di clonaggio multiplo, è costituita da un tratto di DNA che contiene delle sequenze, dette siti di restrizione, che sono riconosciute come siti di taglio da parte di enzimi di restrizione.
3.Cosmidi Un cosmide è un vettore che utilizza specifici geni di ("lambda"). I cosmidi sono vettori plasmidici in cui sono stati inseriti i siti cos (estremità coesive) del genoma di . Questi siti sono richiesti per impacchettare il DNA nel virione di . I plasmidi modificati possono essere impacchettati in vitro nel virione , e le particelle fagiche utilizzate per infettare Escherichia coli. Quindi, utilizzando i cosmidi, non è richiesta la trasformazione di E. coli, processo poco efficiente.
4.Batteriofagi I fagi (o batteriofagi) sono batteri formati da una coda e da una testa nella quale è contenuto il genoma che rilascia una volta infettata la cellula. I fagi atti al clonaggio sono il fago λ e il fago M13. Il fago λ permette clonazioni piccole, al massimo fino a 20 kb, ciò è dovuto al suo DNA impacchettato nella testa di forma icosaedrica. La coda, invece, è formata da costituenti codificati dal genoma del fago. Il fago M13, invece, è più efficiente e riesce a clonare DNA di grandi dimensioni in quanto il suo unico filamento genetico non ha vincoli. Il fago M13 è denominato anche maschio-specifico poichè entra nella cellula ospite attraverso il pilus, un'appendice batterica che favorisce l'interazione con altri organismi.
5.BAC Un Bacterial Artificial Chromosome (BAC) è un vettore di DNA creato artificialmente e basato sul plasmide F isolato da E. coli. Il BAC si dinstigue per la capacità di trasportare una quantità maggiore di DNA rispetto ai vettori naturali. Infatti oscilla tra i 100 kb e 300 kb, 10-30 volte maggiore ai plasmidi.
6.YAC Gli Yeast artificial Chromosome (YAC) sono vettori cromosomici eucariotici artificiali di lievito che possiedono telomeri, centromeri a più punti di duplicazione. Possiedono, inoltre, diversi siti di restrinzione che permettono loro di avere una capacità di trasportare fino a 1400 kb, fino ad oggi sono tra tutti, i vettori che trasportano più regioni del DNA.