Utente:Fede lucy/Sandbox

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Live imaging a singola cellula[modifica | modifica wikitesto]

Live imaging a singola cellula è una tecnica di imaging che sta emergendo nell’ambito della biologia dei sistemi, utilizzata principalmente per studiare il comportamento e le dinamiche di segnalazione cellulare di singole cellule all’interno di una popolazione eterogenea.[1][2]

Il live imaging su cellule vive rappresenta un passo in avanti nello studio della biologia molecolare poichè consente di distinguere comportamenti eterogenei all’interno della stessa popolazione cellulare che altrimenti verrebbero persi nella media della popolazione di cellule analizzate tramite classici assay come il western blot [3]

In un classico esperimento di live cell imaging a singola cellula un reporter fluorescente viene introdotto in una linea cellulare per misurare i livelli, la localizzazione o l’attività di una molecola di interesse. Per mantenere la vitalità delle cellule e ridurre lo stress per l’intera durata dell’esperimento, i microscopi a fluorescenza utilizzati sono dotati di sistemi di incubazione per il controllo di temperatura, umidità e tensione di anidride carbonica e ossigeno. Specifici software consentono di effettuare in maniera automatizzata il tracking di cellule e l’estrazione delle caratteristiche di interesse del reporter fluorescente nel corso del tempo, al fine di comprendere maggiormente alcuni meccanismi biologici.

Background[modifica | modifica wikitesto]

Il live imaging a singola cellula trova le sue fondamenta partendo dalla scoperta che la Green Fluorescent Protein, proteina isolata nella specie di medusa Aequorea victoria, può essere espressa in organismi viventi.[4] Questa scoperta ha consentito ai ricercatori di studiare la localizzazione e I livelli di proteine in singole cellule viventi, come l’attività delle chinasi,[5] o l'analisi dei livelli di calcio, attraverso l'uso di FRET reporters,[6] o di altri possibili marcatori fluorescenti.[7]

I primi studi di localizzazione di queste proteine etichettate con proteine fluorescenti ad un livello subcellulare vennero eseguiti per brevi periodi di tempo. Tuttavia, studi pioneristici sul soppressore tumorale p53[8] e sul fattore di trascrizione NF-κB[9], hanno rivelato livelli e localizzazioni di fluorescenza che oscillano nel tempo per alcune ore. Approcchi di live imaging a singola cellula sono stati anche applicati per studiare l'attività di altri organismi, inclusi batteri[10] e lieviti[11]

Work Flow sperimentale[modifica | modifica wikitesto]

Tag fluorescenti[modifica | modifica wikitesto]

In ogni esperimento di live imaging a singola cellula, il primo passo è quello di inserire un reporter fluorescente per marcare la proteina/molecola di interesse in una linea cellulare di riferimento. Gran parte degli sviluppi in questo ambito è dovuto ai strumenti di editing genetico (come il sistema CRISPR), che ha consentito di sviluppare un’ampia varietà di reporter fluorescenti.[12][13] [14][15]

Live Imaging[modifica | modifica wikitesto]

Il live imaging di cellule che presentano un reporter fluorescente richiede una serie di attenzioni. Per prima cosa, le cellule devono trovarsi in un ambiente controllato in termini di temperatura, umidità e tensione di anidride carbonica e ossigeno per l'intera durata dell'esperimento. Altri fattori da tenere in considerazione nell'impostazione dell'esperimento riguardano l'intensità dell'illuminazione e la frequenza di acquisizione di immagini:

  • Tossicità: l'esposizione alla luce di eccitazione pr lunghi periodi di tempo sottopone a stress le cellule che possono entrare in apoptosi
  • Fotobleaching: elevate intensità di esposizione e alte frquenze di acquisizione di imaging possono portare ad una diminuzione della fluorescenza di un campione dovuta alla degradazione del fluoroforo
  • Rapporto segnale/rumore: Imaging a bassa intensità o fluorofori di scarsa qualità possono impedire di rilevare bassi livelli della molecola fluorescente di interesse

Automatizzazione del tracking cellulare[modifica | modifica wikitesto]

Una volta acquisito l’esperimento di live imaging delle cellule di interesse, software specifici per il tracking automatizzato vengono utilizzati per estrarre dati dai video ottenuti. Questo tipo di analisi è generalmente divisa in due parti, la segmentazione di immagine delle cellule o dei loro nuclei e il seguente tracking e/o quantificazione della molecola fluorescente in base alle precedenti segmentazioni. Alcune delle difficoltà presenti in questa fase[16], sono state in parte superate da software codificati da diversi gruppi di ricerca.[17][18]


Ambiti di applicazione attuali[modifica | modifica wikitesto]

Grazie al live imaging a singola cellula, è possibile analizzare l'eterogeneità nelle dinamiche di una popolazione di cellule e capire come queste dinamiche influenzino l'interno processo biologico di interesse. Ad esempio, studi di live imaging sul fattore di crescita ERK hanno dimostrato che queso possiede un'attivazione digitale "tutto o niente". [19]. Inoltre, questa attivazione tutto-o-niente era pulsatile e la frequenza degli impulsi, a sua volta, determinava se le cellule si sarebbero impegnate a entrare nel ciclo cellulare o no. In un altro esempio, lo studio dell'attività della ciclina CDK2 in cellule vive ha dimostrato che in seguito a mitosi, CDK2 può determinare o proliferazione cellulare o fare entrare le cellule in uno statodi quiescienza.[20]. Sempre grazie ad indagini a singola cellula, è stato dimostrato che questo duplice comportamento è causato da danni stocastici al DNA che inducono una upregolazione di p21, che inibisce l'attività di CDK2.[21]

  1. ^ Suzanne Gaudet, Redefining Signaling Pathways with an Expanding Single-Cell Toolbox, in Trends in Biotechnology, vol. 34, n. 6, Elsevier BV, 2016, pp. 458–469, DOI:10.1016/j.tibtech.2016.02.009. URL consultato il 20 marzo 2017.
  2. ^ Sam Cooper, Accelerating Live Single-Cell Signalling Studies, in Trends in Biotechnology, Elsevier BV, 2017, DOI:10.1016/j.tibtech.2017.01.002. URL consultato il 20 marzo 2017.
  3. ^ Jerem E. Purvis, Encoding and Decoding Cellular Information through Signaling Dynamics, in Cell, vol. 152, n. 5, Elsevier BV, 2013, pp. 945–956, DOI:10.1016/j.cell.2013.02.005. URL consultato il 20 marzo 2017.
  4. ^ Chalfie, Martin. "Green fluorescent protein as a marker for gene expression." Trends in Genetics 10.5 (1994): 151.
  5. ^ T. Ng, Imaging Protein Kinase C Activation in Cells, in Science, vol. 283, n. 5410, American Association for the Advancement of Science (AAAS), 1999, pp. 2085–2089, DOI:10.1126/science.283.5410.2085. URL consultato il 20 marzo 2017.
  6. ^ Roger Y. Tsien, Fluorescent indicators for Ca2+based on green fluorescent proteins and calmodulin, in Nature, vol. 388, n. 6645, Springer Nature, 1997, pp. 882–887, DOI:10.1038/42264. URL consultato il 20 marzo 2017.
  7. ^ R. Y. Tsien, BIOCHEMICAL IMAGING:Seeing the Machinery of Live Cells, in Science, vol. 280, n. 5371, American Association for the Advancement of Science (AAAS), 1998, pp. 1954–1955, DOI:10.1126/science.280.5371.1954. URL consultato il 20 marzo 2017.
  8. ^ Galit Lahav, Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells, in Nature Genetics, vol. 36, n. 2, Springer Nature, 2004, pp. 147–150, DOI:10.1038/ng1293. URL consultato il 20 marzo 2017.
  9. ^ D. E. Nelson, Oscillations in NF-kB Signaling Control the Dynamics of Gene Expression, in Science, vol. 306, n. 5696, American Association for the Advancement of Science (AAAS), 2004, pp. 704–708, DOI:10.1126/science.1099962. URL consultato il 20 marzo 2017.
  10. ^ Gürol M. Süel, An excitable gene regulatory circuit induces transient cellular differentiation, in Nature, vol. 440, n. 7083, Springer Nature, 2006, pp. 545–550, DOI:10.1038/nature04588. URL consultato il 20 marzo 2017.
  11. ^ Jan M. Skotheim, Positive feedback of G1 cyclins ensures coherent cell cycle entry, in Nature, vol. 454, n. 7202, Springer Nature, 2008, pp. 291–296, DOI:10.1038/nature07118. URL consultato il 20 marzo 2017.
  12. ^ Live cell imaging of low- and non-repetitive chromosome loci using CRISPR-Cas9, in Nature Communications, vol. 8, 14 March 2017, p. 14725, DOI:10.1038/ncomms14725.
  13. ^ Olivier Pertz, Spatiotemporal dynamics of RhoA activity in migrating cells, in Nature, vol. 440, n. 7087, Springer Nature, 2006, pp. 1069–1072, DOI:10.1038/nature04665. URL consultato il 20 marzo 2017.
  14. ^ Sergi Regot, High-Sensitivity Measurements of Multiple Kinase Activities in Live Single Cells, in Cell, vol. 157, n. 7, Elsevier BV, 2014, pp. 1724–1734, DOI:10.1016/j.cell.2014.04.039. URL consultato il 20 marzo 2017.
  15. ^ Live-cell reporters for fluorescence imaging, in Current Opinion in Chemical Biology, vol. 20, June 2014, pp. 36–45, DOI:10.1016/j.cbpa.2014.04.007.
  16. ^ Stavroula Skylaki, Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics, in Nature Biotechnology, vol. 34, n. 11, Springer Nature, 2016, pp. 1137–1144, DOI:10.1038/nbt.3713. URL consultato il 20 marzo 2017.
  17. ^ Measuring Signaling and RNA-Seq in the Same Cell Links Gene Expression to Dynamic Patterns of NF-κB Activation, in Cell Systems, vol. 4, n. 4, April 2017, pp. 458–469.e5, DOI:10.1016/j.cels.2017.03.010.
  18. ^ M. Maska, A benchmark for comparison of cell tracking algorithms, in Bioinformatics, vol. 30, n. 11, Oxford University Press (OUP), 2014, pp. 1609–1617, DOI:10.1093/bioinformatics/btu080. URL consultato il 20 marzo 2017.
  19. ^ John G. Albeck, Frequency-Modulated Pulses of ERK Activity Transmit Quantitative Proliferation Signals, in Molecular Cell, vol. 49, n. 2, Elsevier BV, 2013, pp. 249–261, DOI:10.1016/j.molcel.2012.11.002. URL consultato il 20 marzo 2017.
  20. ^ Sabrina L. Spencer, The Proliferation-Quiescence Decision Is Controlled by a Bifurcation in CDK2 Activity at Mitotic Exit, in Cell, vol. 155, n. 2, Elsevier BV, 2013, pp. 369–383, DOI:10.1016/j.cell.2013.08.062. URL consultato il 20 marzo 2017.
  21. ^ Alexis R. Barr, DNA damage during S-phase mediates the proliferation-quiescence decision in the subsequent G1 via p21 expression, in Nature Communications, vol. 8, Springer Nature, 2017, DOI:10.1038/ncomms14728. URL consultato il 20 marzo 2017.
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