Utente:Iride Lucrezia Rosso/Sandbox
La Resistenza Sistemica Acquisita[modifica | modifica wikitesto]
La Resistenza Sistemica Acquisita, dall'inglese Systemic Acquired Resistance, abbreviata SAR, è una risposta di difesa vegetale che si attiva in seguito all'attacco di patogeni. La sua peculiarità è che è una risposta ad ampio spettro, cioè coinvolge sia il sito dell'infezione che le zone distali della pianta, ed è una risposta ad ampio raggio, in quanto la pianta infetta invia segnalazioni volatili alle piante limitrofe, le quali iniziano a produrre molecole immunitarie per prepararsi a un attacco patogeno andando ad acquisire la capacità preventiva di proteggersi.
La Resistenza Sistemica Acquisita è oggetto di studio delle ultime ricerche più interessanti della fisiologia vegetale.
La scoperta[modifica | modifica wikitesto]
Le indagini sulla Resistenza Sistemica Acquisita sono diventate sempre più importanti, oggi sono uno dei campi più indagati, ma la storia è lunga[1] e si prospetta esserlo anche negli anni a venire.
L'ipotesi che le piante, in seguito ad attacco patogeno, sviluppino immunità per proteggersi da future infezioni non è recente, ma risale al 1933 e alle ricerche di Kenneth Chester[2]. Un'ipotesi che però rimase nell’oblio per trent'anni, fino a quando gli studi di Archibal Frank Ross, nel 1961, non rilevarono l'esistenza di un meccanismo di difesa, all'epoca del tutto ignoto. Nei suoi studi, Ross inoculava le foglie della pianta di tabacco (Nicotiana tabacum) con provette contenenti il virus del mosaico del tabacco. Il meccanismo di difesa che si innescava aveva caratteristiche completamente innovative e sorprendenti rispetto a tutti i meccanismi di difesa precedentemente identificati. Questo meccanismo stupì subito per la peculiarità di innescare una difesa sia nel sito infetto che in più parti della pianta stessa, in maniera sistemica, e anche nelle piante a essa vicine. Così Ross battezzò questo meccanismo di difesa come “Systemic Acquired Resistance”[3], abbreviato SAR. Col procedere degli studi, Ross notò che nei tessuti distali si accumulavano proteine PR, e partendo da queste dimostrazioni, nel 1979, Raymond White[4] mostrò che l’espressione dei geni PR può essere indotta trattando le piante direttamente con l'acido salicilico (SA) e un suo derivato, l’acido acetilsalicilico (ASA). Si arrivò a porre sotto i riflettori l'acido salicilico, i cui effetti terapeutici sugli animali erano noti da millenni ma la cui funzione nella pianta è rimasta sconosciuta fino al XX secolo.
Ad oggi, la Resistenza Sistemica Acquisita è definita come un’immunità sistemica, ad ampio spettro e di lunga durata, che, in seguito ad attacco patogeno da parte di virus, prevede la traslocazione di segnali dal sito di infezione alle zone distali. In queste zone, la Resistenza Sistemica Acquisita si traduce in un maggiore stato di preparazione contro infezioni successive, in cui i tessuti sono pronti ad attivare difese più forti e tempestive.
I livelli di difesa delle piante[modifica | modifica wikitesto]
Il sistema immunitario vegetale, come quello animale, è composto da più livelli di difesa. Per eludere dall'infezione patogena la pianta ha, infatti, più modalità d'intervento. In prima linea c'è la barriera chimico-meccanica preformata ma se questa viene varcata si innescano difese attive. Sulla membrana plasmatica sono presenti recettori PRR (Pattern Recognition Receptors) che riconoscono modelli molecolari altamente conservati di patogeni, PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) e MAMP (Microbe-Associated Molecular Patterns); in seguito al riconoscimento di PAMP/MAMP, si attiva la risposta di difesa della PTI (Pattern Triggered Immunity), che, in genere, riesce con successo a fermare ulteriori ingressi.
Talvolta, però, la PTI non basta. Allora la pianta attiva un successivo livello difensivo: la ETI (Effector Triggered Immunity), mediata da proteine R, intracellulari, che riconoscono, direttamente o indirettamente, gli agenti patogeni. La ETI è la versione amplificata della PTI in quanto comporta una reazione ipersensibile (HR) ed è provato che sia più veloce e intenso.
Sia PTI che ETI attivano le difese localmente.
Queste difese locali prevedono:
- la generazione di ROS (Specie Reattive dell'Ossigeno);
- l’aumento della concentrazione di Ca2+;
- l’attivazione delle MAPKs;
- l’accumulo dell'acido salicilico;
- e la sintesi di composti antibatterici.
Successivamente, l’ETI e il PTI possono indurre risposte immunitarie a livello sistemico, tra cui la Resistenza Sistemica Acquisita, che conferisce resistenza ad ampio spettro, di lunga durata, e maggiore stato di preparazione negli organi non infetti contro infezioni successive.
La Resistenza Sistemica Acquisita è stata dimostrata in numerose specie dicotiledoni, mentre nelle monocotiledoni la sua funzione è meno chiara.
I segnali mobili della Resistenza Sistemica Acquisita[5][modifica | modifica wikitesto]
Per sviluppare la Resistenza Sistemica Acquisita, nel tessuto infetto deve venire generato un segnale mobile, il quale viaggia lungo i tessuti conduttori per raggiunge gli organi distali.
Una volta giunto negli organi distali stimola la sintesi e l'accumulo dell'acido salicilico, responsabile principale della Resistenza Sistemica Acquisita.
Grazie a numerosi esperimenti, tuttora in corso, i segnali mobili scoperti sono cinque. Questi segnali mettono in comunicazione l'organo infetto con quelli distali e innescano la Resistenza Sistemica Acquisita, ma sono metaboliti diversi per natura e per meccanismo d'azione. Sono i seguenti:
- Il metilsalicilato (MeSA);
- Il deidroabietinale (DA);
- L'acido azelaico (AzA);
- Il glicerolo-3-fosfato (G3P);
- L'acido pipecolico (Pip).
In virtù degli ultimi studi è stato dimostrato che questi segnali mobili, in grado di innescare la Resistenza Sistemica Acquisita, sono del tutto inutili in assenza dell'acido salicilico.
In Arabidopsis difettosi nella sintesi dell'acido salicilico, a causa di mutazioni nel gene SA INDUCTION DEFICIENT 2 (SID2), anche detta ISOCHORISMATE SYNTHASE 1 (ICS1), qualsiasi segnale mobile non ha alcuna capacità di dare avvio alla Resistenza Sistemica Acquisita, in quanto, in assenza dell'acido salicilico, non parte il pathway funzionale.
Il metilsalicilato[6][modifica | modifica wikitesto]
Il primo metabolita mobile è il metilsalicilato (MeSA), estere dell'acido salicilico e del metanolo. Va sottolineato che è un composto altamente volatile e ha un ruolo cruciale nell'indurre la Resistenza Sistemica Acquisita nelle piante limitrofe alla pianta infetta.
Nel tabacco, due sono i geni cruciali per l’attivazione della Resistenza Sistemica Acquisita mediata dal MeSA:
- SA METHYLTRANSFERASE 1 (SAMT1) omologo di AtBSMT1, che codifica per la metiltransferasi che dall'acido salicilico genera MeSA;
- SA-BINDING PROTEIN 2 (SABP2) omologo di AtMES, che codifica per la MeSA esterasi che converte MeSA in acido salicilico.
Il modello più accreditato propone che, per l’attivazione della Resistenza Sistemica Acquisita, SAMT1 sintetizza MeSA, il quale viene trasportato fuori dalla foglia in cui è stato sintetizzato e, una volta arrivato nelle foglie distali, viene idrolizzato, da SABP2, in acido salicilico.
Un’alterazione missense di Ser81 in Ala81 basta a provocare la perdita dell’attività esterasica di SABP2 e la totale inabilità di indurre la Resistenza Sistemica Acquisita.
Ma la Resistenza Sistemica Acquisita è maggiormente compromessa nei mutanti Ntsabp2 e Atbsmt1, nei quali manca la conversione dell'acido salicilico in MeSA.
Nonostante le mutazioni, i report concludono che la Resistenza Sistemica Acquisita viene comunque indotta, lasciando intuire che molti fattori regolino un network più complicato di quello che si conosce. Ruolo cruciale è svolto da DEFECTIVE IN INDUCED RESISTENCE 1 (DIR1), una LPT (lipid-transfer protein) localizzata nelle cellule cribrose e compagne, dotata di un peptide segnale all’N-terminale che lo destina alla secrezione dalla superficie cellulare, e di due domini SH3, noti per facilitare l’interazione tra proteine; DIR1 inibisce BSMT1: nei mutanti dir1, infatti, aumentando l’espressione di BSMT1, aumenta la quantità di acido salicilico convertito in MeSA, perciò negli organi sistemici, MeSA si accumula, e l'acido salicilico diminuisce.
Va notato che MeSA viaggia, non solo nel floema, ma anche nell’aria per indurre risposte di difesa nelle piante vicine non infette.
Il deidroabietinale[7][modifica | modifica wikitesto]
Il secondo segnale mobile è il deidroabietinale (DA), un diterpene membro della famiglia degli abietani[8].
Nel 2012, Chaturvedi, purificando il DA, scopre che è uno dei migliori induttori della Resistenza Sistemica Acquisita: applicato localmente in Arabidopsis, viene rapidamente trasportato nel floema, destinato a foglie sistemiche, portando all’accumulo dell'acido salicilico e all’espressione di PR1.
La sua peculiarità è che la concentrazione non aumenta nelle foglie inoculate, ma legandosi a un composto, ancora ignoto, si arricchisce nella frazione HMW (high molecular weight, >100 kD), e diventa biologicamente attivo.
Quindi, per essere attivo deve necessariamente venire legato da tale composto ignoto nella porzione HMW, passando dal pool biologicamente inattivo LMW (low molecular wight) a quello biologicamente attivo, HMW.
L'acido azelaico[9][modifica | modifica wikitesto]
Altro segnale mobile è l’acido azelaico (AzA), un acido dicarbossilico con nove atomi di Carbonio che velocizza e aumenta l’accumulo di acido salicilico nei tessuti distali, a cui segue una più rapida ed efficiente espressione di PR1.
Importante per la sua sintesi è l’ossidazione dell’acido 9-oxanonanoico sintetizzato, da acidi grassi insaturi a diciotto atomi di Carbonio, grazie a una lipossigenasi e una idroperossidoliasi. In Arabidopsis, sono state rinvenute due lipossigenasi: LOX1 e LOX5; nei doppi mutanti di queste due lipossigenasi, diversamente da quanto ci si aspettava, l’AzA non era assente, perché l’inoculazione batterica induce radicali liberi, con effetto secondario la perossidazione dei galattolipidi, quindi, in via indiretta, l’accumulo di AzA.
Il movimento sistemico di AzA non può prescindere dalla proteina di trasporto AZELAIC ACID INDUCED 1 (AZI1), e il suo paralogo EARLY ARABIDOPSIS ALUMINUM INDUCED 1 (EARLY1). Secondo alcuni autori, occorre anche DIR1. Ricerche recenti sostengono che sia AZI1, EARLY1 che DIR1, siano localizzate sulla membrana plasmatica, sul reticolo endoplasmatico e nei punti di contatto tra re e cloroplasto, ma solo AZI1 ed EARLY1 siano sulla membrana esterna del cloroplasto. Le tre proteine interagiscono tra loro, come lo dimostra il fatto che la sovraespressione di DIR1, o AZI1, ripristina la Resistenza Sistemica Acquisita nel reciproco mutante azi1 o dir1.
AzA induce la sintesi e l’accumulo di glicerolo-3-fosfato, un altro segnale mobile della Resistenza Sistemica Acquisita.
Il glicerolo-3-fosfato[10][modifica | modifica wikitesto]
Il glicerolo-3-fosfato (G3P), dalla foglia infetta, per via simplastica arriva al floema, e intrecciando il pathway dell'acido salicilico, induce la Resistenza Sistemica Acquisita nei tessuti sistemici.
Il G3P, oltre a essere un noto precursore di lipidi di membrana e stoccaggio, è un segnale mobile della Resistenza Sistemica Acquisita: sia nei tessuti inoculati che in quelli distali aumenta il G3P, anche se si suppone sia un fattore G3P-dipendente a muoversi nei vasi conduttori e che l’accumulo sistemico di G3P derivi da una sintesi de novo.
Di recente si è scoperto che DIR1 è funzionale alla sua traslocazione, e si pensa che, a mediare l’interazione G3P-DIR1, intervenga il fattore G3P-dipendente, ancora ignoto. Infine, l’accumulo sistemico di G3P regola l’espressione dell'acido metilsalicilico (MES) e BSMT1, attivando il primo e inibendo il secondo, per promuovere la riconversione di MeSA in acido salicilico.
L'acido pipecolico[11][modifica | modifica wikitesto]
L’ultimo metabolita mobile della Resistenza Sistemica Acquisita oggi noto è l’acido pipecolico (PIP), un amminoacido ciclico scoperto nel ’53 da Morrison.
La biosintesi del PIP procede attraverso ALD1, un'aminotransferasi che converte l'aminoacido Lys in acido alfa-ketocaproico (KAC), il quale, ciclizzando, forma l’acido 1,2-deidropipecolico (1,2-DP).
Il PIP viene poi generato dalla riduzione, mediata dalla reduttasi SARD4, di 1,2-DP, o dal suo isomero 2,3-deidropipecolico (2,3-DP).
Ultimo passaggio, il PIP viene N-idrossilato dalla monossigenasi FMO1, per generare l'acido N-idrossipipecolico (NHP).
Sia PIP che NHP si accumulano nelle foglie localmente infette e distali dopo l'infezione. L'accumulo di PIP sovraregola trascrizionalmente l'espressione dei geni di biosintesi NHP, ALD1,SARD4 e FMO1.
Il PIP è un amminoacido solubile, quindi per le sue proprietà fisicochimiche è adatto a viaggiare nel floema.
Analisi di singoli e doppi mutanti di sid1 e ald1 suggeriscono che l’accumulo sistemico dell'acido salicilico richiede di ALD1, mentre l’accumulo sistemico di PIP è ridotto ma non annichilito dalla perdita di SID2. Nel 2016, infatti, si è ipotizzata una via di segnalazione, per l’attivazione della Resistenza Sistemica Acquisita, indipendente dall'acido salicilico, e dipendente dal PIP.
La dialettica PIP e SA è ancora poco chiara; oggi si sa che a livello del tessuto infetto, acido salicilico e PIP sono indipendenti, ma a livello del tessuto distale, la storia cambia: l’aumento dell'acido salicilico è completamente dipendente dall’ALD1, e quindi dalla biosintesi di PIP, e dalla segnalazione coinvolgente FMO1; e l’aumento di PIP si basa fortemente sulla biosintesi del SA mediata da FMO1 e ICS1. È stato evidenziato che il PIP migliora sia la propria biosintesi che la segnalazione a valle della Resistenza Sistemica Acquisita, attraverso l’amplificazione dell’espressione di ALD1 e FMO1, indicando l’esistenza di un feedback positivo. FMO1, una monossigenasi flavina-dipendente, importante regolatore della Resistenza Sistemica Acquisita nell’accumulo sistemico dell'acido salicilico: nei mutanti fmo1, a differenza dei mutanti ald1, anche con applicazioni esogene di PIP, non parte la Resistenza Sistemica Acquisita, dunque FMO1 deve funzionare a valle di PIP e a monte dell'acido salicilico.
PHYTALEXIN DEFICIENT 4 (PAD4) è un altro regolatore della biosintesi dell'acido salicilico e della segnalazione a valle; nel percorso del PIP gioca un doppio ruolo: promuove la produzione di PIP indotta da patogeni, e a valle del signaling di quest’ultimo induce la Resistenza Sistemica Acquisita, regolando a livello trascrizionale i geni ALD1, FMO1 e ICS1.
Signaling molecolare della Resistenza Sistemica Acquisita[modifica | modifica wikitesto]
Vediamo cosa avviene esattamente a livello molecolare quando, in seguito a un'infezione virale, si attiva la Resistenza Sistemica Acquisita. Prima prendiamo in considerazione il tessuto locale infetto e successivamente il tessuto distale.
Nel tessuto infetto, dove ci sono i virus, si attivano le prime risposte difensive inducendo il loop autocatalico tra le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e l'ossido nitrico (NO). Questo loop stimola l’espressione di ICS1, responsabile della sintesi e dell'accumulo dell'acido salicilico. Punto cruciale, quindi, è la sintesi e l'accumulo locale dell'acido salicilico il quale, ad alta concentrazione, inibisce l’attività MeSA esterasica di MES. Se MES è inibito allora può funzionare l'enzima antagonista, cioè BMT1 che converte l'acido salicilico in MeSA. A questo punto, l'acido salicilico inizia a diminuire e comincia ad accumularsi il MeSA che, però, non rimane a lungo nel tessuto infetto perchè entra nel floema. Il MeSA, per le sua caratteristiche chimiche è perfetto per spostarsi nel floema. Il floema è l'autostrada in cui viaggiano i segnali mobili per raggiungere i tessuti distali. In alternativa al floema, il MeSA può raggiungere i tessuti distali anche per via aerea. Principalmente, il MeSA sfrutta quest'ultima via per raggiungere le piante limitrofe.
Sempre nel tessuto infetto, l’infezione porta alla sintesi del PIP, il quale viene sintetizzato dalla Lys grazie all’attività tandem di ALD1 e SARD4.
Inoltre, si ha l'accumulo di AzA, ma il meccanismo molecolare è ancora incerto: un segnale “x”, indotto dall’invasione, in combinazione con digalattosildiacilglicerolo (DGDG) innesca l’ossido nitrico (NO) e l’accumulo dell'acido salicilico. Le specie reattive dell'ossigeno, dando avvio al loop autocatalitico con l'ossido nitrico (NO), catalizzano la formazione di AzA attraverso la scissione di acidi grassi, i quali si legano al monogalattosildiacilglicerolo (MGMG) oppure al DGDG. Il movimento di AzA, attraverso il floema, dipende da AZI1 ed EARLY1.
L’AzA induce la sintesi del G3P, il cui accumulo è ulteriormente promosso da un feedback positivo che coinvolge AZI1 e DIR1, quindi la concentrazione è sempre più in crescita.
Rispetto a tutti i segnali precedenti, il livello del DA, nel tessuto infetto, non cambia, ma forma un complesso bioattivo con un composto ignoto (DA*). La Resistenza Sistemica Acquisita indotta dal DA* e da AzA dipende, per la mobilità, da DIR1.
Infine, la Resistenza Sistemica Acquisita è associata all'emissione di monoterpeni (Mt), per la cui sintesi è necessaria la GERANYLGERANYL REDUTTASE (GGR), subunità con attività di reduttasi della GERANYLGERNYL SYNTHASE (GGS). I monoterpeni avendo un basso peso molecolare sono molecole volatili: vengono emessi dagli stomi fogliari, viaggiano nell'aria e raggiungono le piante vicine.
Nel tessuto sistemico, il MeSA arriva, come abbiamo detto, tramite il floema o per via area. In questo tessuto, viene riconvertito in acido salicilico grazie all’attività esterasica di MES. Quindi, intanto che il MeSA arriva, il MeSA viene convertito in acido salicilico, e l'acido salicilico si accumula.
Diversi segnali influenzano la riconversione di MeSA in acido salicilico perché l’espressione di MES è attivata dal DA* e il G3P, mentre BSMT1 è inibita da DIR1 e il G3P. L’accumulo sistemico dell'acido salicilico è regolato anche da un ciclo di amplificazione che coinvolge il PIP, ALD1, SARD4, FMO1 e ICS1, in cui: PAD4 promuove l’espressione di ALD1, FMO1 e ICS1; il DA* e l'AzA alimentano questo ciclo perché richiedono FMO1 per indurre la Resistenza Sistemica Acquisita; e il PIP induce la Resistenza Sistemica Acquisita attraverso il percorso dipendente dall'acido salicilico e NPR1, ma, secondariamente, può indurre la Resistenza Sistemica Acquisita anche attraverso un pathway indipendente dall'acido salicilico, che coinvolge NPR1. Infine, i monoterpeni inducono la Resistenza Sistemica Acquisita con un meccanismo attualmente sconosciuto ma che richiede la segnalazione di SA.
Siamo arrivati, dunque, all''acido salicilico, il baricentro della Resistenza Sistemica Acquisita, che tratteremo nei prossimi paragrafi. L'acido salicilico convertito dal MeSA induce o anticipa le risposte di difesa sistemica grazie a un network in cui NPR1 è il co-attivatore di PR1.
L'acido salicilico[modifica | modifica wikitesto]
L'acido salicilico, o meglio acido 2-idrossibenzoico, è un acido carbossilico incolore cristallino, coinvolto in molti processi vegetali diversi, tra cui induzione fiorale, chiusura stomatica, germinazione, termogenesi, sviluppo radicale, e segnalazione della difesa immunitaria.
I salicilati furono purificati per la prima volta nel 1828 da Buchner, isolando dalla corteccia di alcuni salici (S. alba, S. fragilis) dei cristalli dal sapore amaro che chiamò “salicina”. Dieci anni dopo, Puria divise la salicina in due: un glucosio e un composto aromatico; quest’ultimo, Puria chiamò: acido salicilico. Inizialmente venne identificato come metabolita secondario, un fenolo, in quanto l’applicazione esogena comportava effetti su crescita e sviluppo. Ma l’identità stessa attribuita all'acido salicilico è in evoluzione continua, il riflesso dei progressi della ricerca: se negli anni ’70 Cleland intuì che il SA fosse un segnale endogeno, solo negli anni ’90 se ne ebbe certezza, una certezza che a tratti vacilla, in un panorama di punti interrogativi.
Le due vie biosintetiche dell'acido salicilico[modifica | modifica wikitesto]
L'acido salicilico viene generato mediante due vie biosintetiche, entrambe hanno sede nel cloroplasto.
La prima via che venne identificata fu la via della fenilalanina ammoniacaliasi (PAL). L’enzima PAL converte la L-fenilalanina (Phe) in acido trans-cinnamico (t-CA) da cui deriva l'acido salicilico tramite l’intermedio acido orto-cumarico o l’acido benzoico (BA). La conversione di BA in acido salicilico avviene grazie all'enzima BA 2-HYDROXYLASE (BA2H) che, però, non è ancora stato purificato.
In seguito alle indagini di laboratorio, si è rilevato che l’espressione dell'enzima PAL influenza poco significativamente l’accumulo dell'acido salicilico: infatti, se vengono silenziati tutti i 4 geni PAL, di Arabidopsis, si decreta una riduzione del 90% dell’attività basale di PAL, ma si rileva la riduzione solo del 50% dell’accumulo dell'acido salicilico, lasciando ipotizzare l’esistenza di una via biosintetica alternativa.
Prima della scoperta di quest’ultima, era noto che generi batterici sintetizzassero acido salicilico dal corismato, il quale viene prodotto nel cloroplasto, dalla via dell’acido shikimico attraverso un intermedio: l’isocorismato (IC).
In alcune specie batteriche, l'acido salicilico deriva dal corismato, mediante un solo enzima, la SA SYNTHASE; in altre, invece, c’è un pathway a due fasi, in cui il corismato isomerizza in IC, grazie alla IC SYNTHASE (ICS), e IC viene convertito in acido salicilico dall’IC PYRUVATO LYASE (IPL – anch’esso non ancora isolato).
Nel 2001 con il sequenziamento del genoma di Arabidopsis, furono identificati due geni ICS. Sapendo che il corismato viene prodotto nel cloroplasto, si ipotizza l'interessante tesi che il corismato sia l’eredità di ancestrali endosimbiosi procariotiche.
La mutazione ics1 comporta un’immunità drasticamente ridotta: l’accumulo di acido salicilico diminuisce fino al 95%. Dunque è la via IC la principale per la sintesi dell'acido salicilico. Grazie alle ricerche, si è scoperto che, rispetto a ICS1, ICS2 è costitutivamente espresso, oltre nel cloroplasto, anche nei tessuti conduttori e negli idatodi, garantendo una minima, ma costante, produzione dell'acido salicilico; in caso di attacco, ICS2 non aumenta di molto la sintesi e recenti analisi biochimiche dimostrano che ICS2 è enzimaticamente attivo ma con un tasso di reazione che è meno della metà di ICS1.
Concludendo, va detto che le due vie biosintetiche dell'acido salicilico si interconnettono, in quanto l’acido corismico, attraverso la CHORISMATE MUTASE (CM), forma l’acido prefrenico che decarbossilato genera Phe.
Regolazione della biosintesi dell'acido salicilico[modifica | modifica wikitesto]
ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 (EDS1) e PAD4 svolgono un ruolo egemone nella regolazione positiva della sintesi e dell'accumulo dell'acido salicilico.
EDS1 è localizzata sia a livello citosolico che nucleare, costituendo complessi nucleari o nucleocitoplasmatici con PAD4, e interagisce con diversi tipi di proteine R. Il pool nucleare e citoplasmatico, però, hanno funzioni differenti:
- Il pool nucleare di EDS1 è cruciale per mediare l’ETI in risposta ad agenti batterici, in particolare biotrofici;
- Il pool citoplasmatico promuove solo l’efficienza.
In seguito all’attivazione di ETI, EDS1 nucleare aumenta rapidamente, precedendo, o coincidendo, con la regolazione trascrizionale di ICS1, PAD4 ed EDS1 stesso: EDS1 e PAD4 stimolano l’espressione di ICS1, e così l’accumulo dell'acido salicilico, il quale, mediante un feedback positivo, favorisce l’espressione di EDS1 e PAD4. In questo modo, viene promossa la sintesi dell'acido salicilico, e conseguente accumulo. Nel 2017 sono stati scoperti diversi fattori di trascrizione (TFs) che legano il promotore di ICS1, lo regolano positivamente, favorendone l’espressione, e conseguente sintesi dell'acido salicilico: CALMODULIN-BINDING PROTEIN 60-LIKE g (CBP60g) e il suo omologo SAR DEFICIENT 1 (SARD1), WRKY28, TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF 8 (TCP8) e CCA1 HIKING EXPEDITION (nota come TCP21).
L’invasione patogena induce l’afflusso di Ca2+ che attiva CBP60g e WRKY28, i quali attivano ICS1. TCP8 funziona in modo ridondante con altri TFs della famiglia TCP e TFs associati a ICS1, quali SARD1, WRK28 e ANAC019: queste interazioni permettono di modulare l’espressione di ICS1, il gradiente di concentrazione dell'acido salicilico, e il crosstalk con altri percorsi di segnalazione.
Regolatori negativi di ICS1, invece, sono diversi TFs della famiglia NAC, quali ANAC019, ANAC055 e ANAC072, ed ETHYLENE INSENSITIVE 3 (EIN3) ed EIN-LIKE 1 (EIL1).
È stato dimostrato che CALCUM-SENSING RECEPTOR (CAS) è un recettore proteico associato ai tilacoidi che lega Ca2+, richiesta per la resistenza basale, ETI, e l’accumulo di SA. Recenti ricerche attestano che ulteriori segnali provenienti dal cloroplasto, ancora sconosciuti, contribuiscano alla regolazione dei geni nucleari associati alla biosintesi dell'acido salicilico.
Regolazione del livello citosolico dell'acido salicilico[modifica | modifica wikitesto]
Una volta sintetizzato l'acido salicilico, deve venire esportato dal cloroplasto al citosol, e una volta nel citosol deve venire inattivato.
Il gene EDS5 (o SID1) codifica per una proteina responsabile dell'esportazione dell'acido salicilico. Una volta nel citosol, l'acido salicilico subisce modifiche per venire inattivato. L’inattivazione è funzionale sia per regolare il livello citosolico dell'acido salicilico attivo, sia per fornire un serbatoio facilmente accessibile e trasportabile in risposta a stress. Mantenere livelli discreti dell'acido salicilico è fondamentale: in assenza di infezioni, l’attivazione costitutiva dell'acido salicilico sarebbe un drenaggio eccessivo di energia, privando risorse a processi di sviluppo e crescita. Ma comunque si deve garantire un pool dell'acido salicilico pronta all’uso. In seguito ad attacco, infatti, gran parte dell'acido salicilico appena sintetizzato viene glucosilato nel gruppo idrossilico per formare il glucoside dell'acido salicilico (SAG). Meno frequentemente la glucosilazione riguarda il gruppo carbossilico per produrre l’estere di glucosio salicilato (SGE).
SAG viene trasportato nel vacuolo, una modalità di stoccaggio, inattivo e non tossico, da cui può essere riconvertito l'acido salicilico al bisogno. Oppure, l'acido salicilico sintetizzato, viene metilato, generando MeSA; questa modifica inattiva l'acido salicilico, ne aumenta la permeabilità di membrana e volatilità, adatta al movimento a lungo raggio.
Sia in vivo che in vitro, si osserva l’incremento del livello di acido 2,3-diidrossibenzoico (2,3-DHBA), e, in misura minore, di 2,5-DHBA, in quanto l’enzima SA 3-HYDROXYLASE (S3H) media la conversione dell'acido salicilico in 2,3-DHBA, per prevenirne l’accumulo.
Un’altra strategia per regolare il livello citosolico è la coniugazione amminoacidica, in cui l'acido salicilico, o un suo precursore – si ipotizza BA – lega l'acido aspartico (Asp), producendo saliciloil-aspartato, generato da un enzima della famiglia delle acil adenilasi, GH3.5.
Un altro enzima della famiglia GH3 è PBS3, ancora poco conosciuto, che coniuga amminoacidi non all'acido salicilico, ma a benzoati, agendo a monte della sintesi dell'acido salicilico; infatti, silenziando GH3.5, cioè la sintesi SA-Asp, comunque non influenza l’accumulo citosolico dell'acido salicilico, regolato da PBS3.
Ultimo enzima scoperto è EPS1, una acil trasferasi, che probabilmente, come PBS3, agisce a monte della sintesi dell'acido salicilico, su precursori o un suo regolatore.
A valle del signaling dell'acido salicilico nella Resistenza Sistemica Acquisita[modifica | modifica wikitesto]
Per decifrare il modo in cui l'acido salicilico modula il sistema immunitario sono stati utilizzati diversi approcci.
- Il primo approccio riguardava l’isolamento di mutanti, principalmente in Arabidopsis. Il successo più notevole di questo approccio genetico fu l’identificazione di NPR1, da parte di quattro gruppi indipendenti di ricerca (Cao et al.; Delaney et al.; Glazebrook et al.; Shah et al.), tutti intorno al ’95.
- Il secondo approccio utilizzava metodi biochimici classici per identificare le SA-BINDING PROTEINs (SABPs) che legavano l'acido salicilico marcata con radio negli estratti proteici preparati primariamente dalle foglie di tabacco. Con questo approccio, sono state rinvenute numerose SABPs con l'osservazione che tutte le proteine che legano l'acido salicilico sono enzimi. Tra queste proteine ci sono: la catalasi (CAT) e l’ascorbato perossidasi (APX), che sono i principali enzimi di riduzione di H2O2, nonché l’anidrasi carbonica (SAPB3) e la MeSA esterasi (SABP2).
- Il terzo approccio ha usato metodi genetici e biochimici per valutare se l'acido salicilico interagisce direttamente/fisicamente con NPR1 e/o i suoi paraloghi NPR3 e NPR4. Nel 2012, i risultati di Fu e colleghi dimostrarono che NPR1 non è un recettore diretto dell'acido salicilico, mentre i suoi paraloghi sì; al contrario, Wu e colleghi sostengono che NPR1 leghi direttamente l'acido salicilico, e dunque sia un recettore[12].
In un modo o nell'altro, tutti gli approcci portano alla scoperta del master-regulator-gene più sorprendente della Resistenza Sistemica Acquisita: NONEXPRESSER OF PR GENES 1 (NPR1), detto anche NON-INDUCIBLE IMMUNITY 1 (NIM1), o SA INSENSITIVE 1 (SAI1)[13]. Mutanti npr1 sono totalmente compromessi nella Resistenza Sistemica Acquisita, nonostante sintesi e accumulo dell'acido salicilico non siano repressi.
NPR1 è il co-attivatore trascrizionale essenziale per la Resistenza Sistemica Acquisita, responsabile dell’attivazione genica della difesa, i cui bersagli sono PR1 e altri geni implicati nel folding e nella secrezione; mutazioni in tali geni, come LUMINAL-BINDING PROTEIN (BIP2), DEFENDER AGAINST APOPTOTIC DEATH (DAD1) e SEC61α, comporta la ridotta secrezione di proteine PR nell’apoplasto.
Strutturalmente, NPR1 contiene un dominio all’N-terminale BTB (Broad-Complex, Tramtrack e Bric a brac), detto anche POZ (POxvirus e Zinc finger), un dominio al C-terminale di transattivazione, un dominio di ripetizioni di anchirina, e un segnale di localizzazione nucleare bipartito. Nel 2015 sono state identificate altre 5 NPR in Arabidopsis, tutte corredate di un dominio BTB e ripetizioni di anchirina. Il dominio BTB, all’N-terminale, è tipico di proteine che interagiscono con CULLIN3-E3 UBIQUITIN LIGASE, la quale etichetta proteine destinate al proteasoma.
NPR1 si trova nel nucleo e nel citosol. Nel nucleo si presenta in forma monomerica e opera come fattore trascrizionale (TF), mentre nel citosol si presenta in forma oligomerica. Gli oligomeri di NPR1 sono connessi da ponti disolfuro, i quali vengono ridotti a causa del potenziale redox innescato dall’infezione patogena, quindi vengono rilasciati monomeri di NPR1 che possono accedere al nucleo. Si è osservato, in Arabidopsis, che 2-3h dal trattamento con acido salicilico si attivano i geni dello stress ossidativo, e dopo 12-16h parte l’espressione genica di PR1 dipendente da NPR1.
Nelle cellule non infette, NPR1 risiede principalmente nel citosol, in versione oligomerica, e quel poco che va nel nucleo viene distrutto dal proteasoma (perché se le cellule non sono infette, non ce n'è bisogno). Nelle cellule inoculate, invece, l’infezione induce il cambio dello stato redox cellulare che porta alla monomerizzazione di NPR1, stabilizzato dal legame con l'acido salicilico, il quale si accumula. I monomeri, nel nucleo, entrano in un ciclico turnover, mediato da CUL3-E3 ligasi e dal proteasoma.
Nella pianta infetta, l'acido salicilico è caratterizzato da un gradiente di concentrazione che diminuisce procedendo dalle foglie inoculate alle foglie distali: questo concetto è fondamentale per il governo del signaling della Resistenza Sistemica Acquisita, motivo per cui nella stessa pianta ci sono modalità differenti con cui si manifestano i pattern della difesa.
NPR1 nel nucleo incontra molti TFs. In particolare, NPR1 può interagire con TGA2, regolando PR1, il cui promotore contiene elementi regolatori negativi che possono essere legati da TGA2, il quale funge da repressione trascrizionale se i livelli dell'acido salicilico sono bassi, ma se aumentano, TGA2 viene incorporato nel complesso di transattivazione con NPR1, in cui il dominio N-terminale di NPR1 interagisce con il dominio repressore di TGA2, inibendone la funzionalità, e andando a stimolare l’attivazione di PR1.
NPR1 lega, con legami dativi, Cu (a livello di Cys521/529): Cu fa da link tra NPR1 e gli atomi O dei gruppi -COOH e -OH dell’anello aromatico di SA; quest’interazione è il trigger del cambio conformazionale di NPR1: il dominio N-terminale, inibendo il dominio C-terminale, blocca la forma oligomerica, ma il cambio conformazionale libera NPR1 dall’autoinibizione, andando a stabilizzare la monomerizzazione, favorendo la traslocazione nucleare, e l’attivazione dei geni della difesa.
La degradazione di monomeri NPR1 nel nucleo è essenziale per regolarne il turnover nella SAR. Una regolazione simile è stata osservata per il TF del lievito, GAL4, un regolatore del metabolismo del galattosio, in assenza del quale, GAL4 viene degradato dal proteasoma impedendo l’attivazione dei geni metabolici, limitando il dispendio energetico.
Nel modello di Spoel si mostra la differenza tra le cellule in cui la Resistenza Sistemica Acquisita è indotta e quelle in cui non lo è. Questo modello viene ben rappresentato dall’immagine seguente.
- Nelle cellule in cui la Resistenza Sistemica Acquisita non è indotta, i monomeri NPR1 traslocano a basso ritmo nel nucleo dove sono destinati, dopo l’ubiquitinazione di CUL3-E3 ligasi, al proteasoma. Vengono eliminati, quindi, i monomeri di NPR1 e viene impedita l'attivazione spuria di geni.
- Nelle cellule in cui la Resistenza Sistemica Acquisita è indotta, un’elevata quantità di monomeri di NPR1 si trasferisce nel nucleo, grazie al trasportatore SNF1-RELATED PROTEIN KINASE 2.8 (SnRK2.8), una Ser/Thr chinasi che fosforila i residui Ser589 e Thr373 di NPR1. Nel nucleo, NPR1 fosforilato interagisce con TFs per avviare la trascrizione genica bersaglio, reclutando il complesso di inizio della trascrizione (IC) e l'RNA polimerasi II (PolII). Di conseguenza NPR1 viene fosforilato da una chinasi associata all'IC e alla PolII, su Ser11/15. CUL3-E3 ubiquitina ligasi mostra un'affinità superiore per NPR1 fosforilato, distinta da quella coinvolta nel turnover di NPR1 non fosforilato in cellule SAR-non indotte: NPR1 viene ubiquitinato rapidamente e rapidamente si procede con la distruzione.
Spoel[14] afferma che lo sgombero di NPR1 fosforilato “exhausted” dal promotore del gene bersaglio consente a NPR1 "fresh" non fosforilato di ricominciare il ciclo di trascrizione, collegando direttamente il tasso di degradazione di NPR1 all'ampiezza della trascrizione genica bersaglio.
Etichettando con trizio (3H) l'acido salicilico è stato dimostrato che quest’ultimo lega direttamente NPR3 e NPR4, le quali sono proteine adattatrici per CUL3-E3 ligasi che ha come target specifico NPR1 fosforilato, e lo destina al proteasoma. Secondo diversi studi, NPR3 ed NPR4 hanno affinità differenti per l'acido salicilico, e, quindi, influenzano significativamente la segnalazione di difesa, agendo da co-repressori trascrizionali: NPR4 ha alta affinità per l'acido salicilico, con una costante di dissociazione (Kd) di 0.046µM, mentre NPR3 ha bassa affinità, con Kd di 1µM. Perciò, NPR4, a basse concentrazioni dell'acido salicilico, lega NPR1, e ne promuove la degradazione, per attenuare l’espressione genica della resistenza basale. Quando però, in seguito allo stabilimento della Resistenza Sistemica Acquisita, l'acido salicilico raggiunge livelli intermedi, il complesso NPR1-NPR4 si dissocia, liberando così NPR1 che può lavorare come TF. In altre parole, quando il livello dell'acido salicilico è molto basso, il livello NPR1 è basso perché NPR4 ne media la degradazione. Quando il livello dell'acido salicilico è molto alto, il livello NPR1 è basso perché NPR3 ne media la degradazione. A livello medio dell'acido salicilico, il livello NPR1 è il più alto perché l'acido salicilico è sufficiente a interrompere l'interazione NPR4-NPR1, ma non sufficiente a facilitare l'interazione NPR3-NPR1.
Il gradiente di concentrazione dell'acido salicilico e l’interazione NPR1 coi paraloghi orchestrano l’omeostasi di NPR1 e i meccanismi di difesa, in cui, accumulo e turnover di NPR1 sono propulsore della Resistenza Sistemica Acquisita.
Per concludere, un numero crescente di prove indica l’esistenza di percorsi di trasduzione del segnale di difesa dipendenti dall'acido salicilico, ma indipendenti da NPR1. Inoltre, non è chiaro se NPR3 e NPR4 siano coinvolti nella capacità dell'acido salicilico di indurre la traslocazione nucleare di NPR1, o promuoverne la fosforilazione per facilitare il turnover, o implicate in tutti gli altri meccanismi molecolari indotti dall'acido salicilico relativi alla crescita e sviluppo. E molti autori sono convinti che il recettore specifico per l'acido salicilico sia ancora un punto interrogativo e un terreno fertile della ricerca.
Note[modifica | modifica wikitesto]
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