Tessuto endoteliale

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Tessuto endoteliale
Microvessel.jpg
Cellule endoteliali, le quali formano la tonaca intima, che circonda un eritrocita (E)

Il tessuto endoteliale è un tipo particolare di tessuto epiteliale pavimentoso non stratificato[1][2] di derivazione mesenchimale che costituisce il monostrato cellulare che riveste la superficie interna dei vasi sanguigni, dei vasi linfatici e del cuore (endocardio).[3] L'endotelio è l'organo più voluminoso del corpo umano, ha un peso totale di 1,0-1,8 Kg e una superficie stimata di circa 400 m2 (secondo altri autori 1000 m2).[4][5]

Le cellule che formano l'endotelio sono chiamate cellule endoteliali: cellule endoteliali vascolari, se in contatto con il sangue, e cellule endoteliali linfatiche, se in contatto con la linfa. Le cellule endoteliali vascolari si trovano nell'intero sistema circolatorio, dal cuore alle vene e sono esposte sia al flusso ematico che ai costituenti plasmatici. La loro struttura presenta variazioni (eterogeneità dell'endotelio) a seconda dei diversi compartimenti cui appartengono (arterioso, venoso e capillare). Vi sono notevoli differenze nelle cellule endoteliali che sono deputate a funzioni di filtraggio speciali; esempi di tali strutture possono essere trovate nei glomeruli renali e nella barriera emato-encefalica.

Sulla base del tipo di contatto che si stabilisce tra le cellule endoteliali, l'endotelio viene classificato in continuo, fenestrato e discontinuo. L'endotelio continuo si ritrova nell'endocardio, nell'intima delle arterie e delle vene e in numerosi distretti capillari (cutanei, muscolari, polmonari, cerebrali, spinali e reitinici), mentre gli altri tipi sono esclusivi di alcuni letti capillari: endotelio fenestrato dei capillari renali e glomerulari, delle ghiandole esocrine ed endocrine, dei villi intestinali e dei plessi coroidei; endotelio discontinuo dei sinusoidi epatici, splenici e midollari.

Le cellule endoteliali svolgono molteplici funzioni di primaria importanza per la biologia vascolare e per il mantenimento dell'omeostasi dell'intero organismo. L'endotelio costituisce una barriera anatomica tra il sangue e l'intima dei vasi o lo spazio interstiziale tessutale: si tratta sia di una barriera fisica semipermeabile che di una interfaccia biologica capace di rispondere ai segnali chimici e meccanici generati dai due compartimenti tra i quali l'endotelio è interposto (vedi Patobiologia dell'aterosclerosi: endotelio e stress meccanici). Le sue funzioni comprendono:

- regolazione della permeabilità vasale;

- regolazione del tono e della struttura dei vasi;

- angiogenesi;

- controllo dell'emostasi;

- controllo dell'infiammazione (es. reclutamento dei neutrofili);

- funzioni endocrino-metaboliche (es. metabolismo delle lipoproteine e di alcuni ormoni).

Etimologia[modifica | modifica wikitesto]

Il primo a riconoscere che i capillari non sono dei semplici passaggi membranosi attraverso i tessuti, ma possiedono una parete cellulare propria, è stato Von Recklinghausen nel 1800; ma ancora nel 1856, nel grande trattato di Todd e Bowman (The physiological anatomy and physiology of man), il rivestimento interno dei vasi era indicato come "strato epiteliale". Il termine endotelio (dal greco endo-, interno, e telé, capezzolo, per la somiglianza con il rivestimento interno del capezzolo) fu proposto dallo svizzero Wilhelm His senior (1831-1904) nel 1865, durante le sue ricerche in campo embriologico, per indicare il rivestimento interno dei vasi e delle cavità pleuriche e peritoneali (attuale mesotelio), distinguendolo dall'epitelio che costituisce il rivestimento delle strutture anatomiche a contatto (diretto o indiretto) con l'ambiente esterno.[6][7] (A His si deve l'invenzione del microtomo nel 1866).

Anatomia microscopica[modifica | modifica wikitesto]

La cellula endoteliale è una cellula pavimentosa mononucleata, di forma poligonale allungata, con prevalenza della morfologia allungata nelle arterie e di quella poligonale nelle vene. La forma allungata, orientata secondo la direzione del flusso sanguigno domina dove il flusso è rapido, unidirezionale e laminare, mentre è meno evidente nei tratti a flusso lento e disturbato. Lo spessore medio delle cellule endoteliali varia da 0,1-0,2 μ nei capillari e nelle vene a 1 μ nell'aorta ed è massima a livello del nucleo (2-3 μ); la lunghezza si aggira intorno ai 30-50 μ e la larghezza ai 10-20 μ. Le cellule endoteliali sono cellule polarizzate, in quanto la superficie luminale è differente da quella abluminale (basale). Le principali differenze morfologiche tra endotelio arterioso e venoso riguardano soprattutto: spessore cellulare (minore nelle vene, ad eccezione delle cosiddette venule post-capillari ad endotelio alto (HEV) dei linfonodi; sviluppo degli apparati giunzionali (molto meno serrati nelle vene, in modo particolare nelle venule post-capillari); abbondanza delle vescicole citoplasmatiche (presenza dei vesiculo-vacuolar organelles o VVO nelle venule post-capillari). Tali differenze strutturali sono in relazione con le caratteristiche emodinamiche (lo shear stress è di 1–5 dynes/cm2 nel settore venoso e di 10–40 dynes/cm2 in quello arterioso) e con la permeabilità.[8]

Il nucleo è ovoidale e allungato e il citoplasma contiene, oltre ai consueti organelli (Golgi, mitocondri, reticolo endoplasmatico, ribosomi, lisosomi e citoscheletro), numerose vescicole (particolarmente abbondanti nei capillari, dove costituiscono circa il 20% del volume cellulare) e i Corpi di Weibel-Palade (WPB). Sono presenti sia vescicole rivestite da clatrina sia vescicole non rivestite contenenti caveolina e cavina.[9] Le vescicole rivestite da clatrina intervengono nell'endocitosi, svolgendo la funzione di trasporto intracellulare, dalla membrana plasmatica agli endosomi o all'apparato di Golgi, come nel caso dell'endocitosi recettore-mediata della transferrina e delle lipoproteine a bassa densità (LDL); le vescicole contenenti caveolina sono molto più numerose, hanno un diametro di 50–70 nm e sono responsabili del trasporto di sostanze attraverso la cellula endoteliale (transcitosi). Mentre l'endocitosi assolve al compito di fornire alla cellule sostanze destinate al proprio metabolismo, la transcitosi interviene nel trasferimento di composti destinati all'ambiente extracellulare. Le vescicole contenenti caveolina sono molto numerose nei capillari non fenestrati:[10] la loro densità varia da 200/μm3 nelle arteriole a 600/μm3 nelle venule postcapillari, per raggiungere 900-1200/μm3 nei capillari, ad eccezione di alcuni letti capillari, come quelli polmonari (130/μm3) e soprattutto la barriera emato-encefalica (<100/μm3).[11] I WPB sono vescicole secretorie specifiche delle cellule endoteliali che al microscopio elettronico appaiono allungate (rod-shaped), con dimensioni di circa 0.2 x 2 μ, elettrondense e di aspetto regolarmente striato per la presenza di strutture tubulari parallele, costituite dai polimeri del Fattore di von Willebrand (VWF).[12] Oltre a VWF, i corpi WPB contengono la proteina adesiva P-selectina.

La superficie cellulare luminale presenta numerose fossette a forma di fiasco, dette caveole (lett. piccole caverne)[13], ed è "rivestita" dal glicocalice e dallo strato endoteliale superficiale (ESL, endothelial superficial layer). Le caveole, invaginandosi, danno origine alle vescicole contenenti caveolina. Il glicocalice è uno strato glicoproteico con spessore variabile a seconda dello stato funzionale della cellula (in media misura circa 60-110 nm). Questo rivestimento è ricco di cariche negative ed è formato da glicoproteine (es. molecole adesive, molecole del sistema emostatico), eparansolfato-proteoglicani (es. sindecano, glipicano) e glicolipidi di membrana, la componente glucidica delle quali sporge dalla superficie della membrana cellulare. Al glicocalice luminale aderiscono molecole plasmatiche che formano un strato molto più spesso (500-1000 nm) che ricopre il glicocalice e che viene indicato come ESL. Sia il glicocalice che l'ESL hanno una notevole importanza funzionale: agiscono da filtro molecolare (influenzando la permeabilità), modulano lo shear stress e inibiscono l'adesione di leucociti e di piastrine.[14] Nei piccoli vasi e nei capillari la presenza di questo strato aumenta le resistenze al flusso e respinge i globuli rossi, tanto che nei capillari l'ematocrito ha valori più bassi rispetto ai valori sistemici. Durante i processi infiammatori il glicocalice viene represso, consentendo l'adesione dei leucociti all'endotelio.

La superficie endoteliale basale possiede anch'essa numerose caveole ed è fermamente ancorata alla membrana basale (vedi anche intima). Tale ancoraggio è opera dl due classi di proteine che mediano l'adesione cellula-matrice extracellulare (ECM), le integrine e gli eparansolfato-proteoglicani (sindecano): quasi tutte le proteine che compongono la ECM possiedono siti di legame per entrambe queste due classi.[15][16] Le integrine e i sindecani presentano un dominio extracellulare (che si lega all'ECM), un dominio transmembranaceo (che attraversa la membrana cellulare) e un dominio intracellulare (che interagisce con il citoscheletro). In tal modo queste molecole adesive si comportano da meccanocettori che rispondono alla deformazione e trasmettono messaggi dall'ambiente extracellulare all'interno della cellula. Le molecole adesive possono essere organizzate in complessi strutturali dinamici chiamati "adesioni focali", piccole regioni elettrondense della membrana cellulare basale. Le adesioni focali hanno di solito forma allungata, con il diametro maggiore di pochi micron, e sono strettamente aderenti alla ECM e direttamente connesse al citoscheletro.[17] La loro impalcatura portante è costituita dalle integrine, ma alla loro formazione partecipano oltre un centinaio di proteine diverse, sindecani inclusi. Le adesioni focali sono complessi macromolecolari dinamici, in quanto vengono assemblate e disassemblate a seconda delle necessità della cellula.

Nell'endotelio continuo, i margini delle cellule endoteliali sono in stretto contatto con le cellule adiacenti, formando spazi intercellulari di circa 15-20 nm di ampiezza, occupati da glicosaminoglicani (lo storico "cemento" intercellulare). Tra le cellule endoteliali contigue si stabiliscono anche zone circoscritte di contatto più ravvicinato, dove le cellule aderiscono intimamente tra loro, in modo da creare una barriera anatomica dinamica che limita la diffusione delle molecole plasmatiche e delle cellule ematiche. Le strutture macromolecolari responsabili di tale intima adesione sono indicate come "complessi giunzionali" (giunzioni cellulari) e sono distinte in: giunzioni aderenti (adherens junctions), giunzioni occludenti (tight junctions) e giunzioni comunicanti (gap junctions). Le giunzioni occludenti sono più numerose nel settore arterioso della circolazione (particolarmente sviluppate nell'endotelio delle grandi arterie), nei capillari il massimo sviluppo si osserva nel sistema nervoso centrale (barriera emato-encefalica), mentre nelle venule post-capillari sono assenti.[10] Le gap junctions permettono la comunicazione intercitoplasmatica tra cellule endoteliali attraverso il passaggio di piccoli soluti (p.m. <1000-1500 daltons), come ioni, metaboliti e secondi messaggeri; sono composte dalle connessine Cx37, Cx40 e Cx43 che fomano canali (connessoni) nella membrana plasmatica. La connessina 43 (Cx43) sembra prevalere nelle sedi di flusso disturbato.[18]

Le giunzioni mio-endoteliali (MEJ) sono estroflessioni della membrana che, spingendosi attraverso discontinuità della lamina elastica interna, mettono in comunicazione diretta le cellule endoteliali con le sottostanti cellule muscolari lisce della tonaca media, consentendo una puntuale coordinazione funzionale tra queste cellule.[19] Proprio per questo le MEJ sono più numerose nelle piccole arterie di resistenza rispetto alle grandi arterie di conduzione: a livello periferico la regolazione endoteliale del tono vasale riveste un'importanza maggiore. Nelle MEJ sono presenti gap junctions che permettono l'accoppiamento elettro-chimico tra endotelio e muscolatura vasale.[20]

Il citoscheletro è formato dai filamenti di actina e dalle proteine ad essi associate (es. miosina, vinculina). Al microscopio elettronico, il citoscheletro delle cellule endoteliali appare organizzato in tre sistemi fondamentali: una rete periferica di filamenti posti subito al di sotto della membrana plasmatica; un addensamento sub-membranoso di microfilamenti in corrispondenza della superficie basale e delle giunzioni intercellulari; fibre dello stress (fasci di microfilamenti) connessi sia con le adesioni focali della membrana plasmatica basale che con la membrana plasmatica apicale.[21] Il citoscheletro è importante per mantenere la morfologia della cellula, per stabilizzare l'integrità delle strutture di adesione e per modulare la permeabilità endoteliale.[22] La riorganizzazione del citoscheletro in risposta agli stress emodinamici (vedi Patobiologia dell'aterosclerosi - Endotelio e stress emodinamici) si accompagna a modificazioni della forma cellulare. L'esposizione a uno stress da attrito (shear stress) elevato induce un maggior sviluppo delle fibre dello stress, uno sviluppo minore della rete periferica di filamenti e un allungamento della forma cellulare; lo shear stress basso ha un effetto opposto sull'organizzazione dei microfilamenti e determina l'assunzione di una forma poligonale.[23]

In alcune condizioni particolari sono state descritte sulla superficie endoteliale cilia primarie solitarie (cilia immobili). Nell'uomo sono state osservate su cellule endoteliali venose ombelicali in coltura (Human Umbelical Vein Endothelial Cells: HUVECs),[24] su cellule endoteliali aortiche embrionali e su cellule endoteliali aortiche di lesioni aterosclerotiche;[25][26] negli animali (topo e coniglio) sono state descritte sia nella fase embrionale che negli animali adulti. Le cilia primarie hanno una lunghezza di 1-5 μ e sono caratterizzate da una struttura interna (assonema) formata da una corona periferica di nove coppie di microtubuli, mentre è assente la coppia centrale di microtubuli (struttura "9+0") che distingue le più comuni cilia mobili (struttura "9+2"). Esse svolgono una funzione meccano-recettoriale: sono capaci di rispondere a forze emodinamiche estremamente basse (0.007 dyne/cm2) e trasmettono segnali chimici (es. Ca+2) e meccanici all'interno della cellula.[27] I segnali meccanici sono trasmessi dai microtubuli dell'assonema al citoscheletro citoplasmatico; le cilia primarie possono rispondere anche a forze meccaniche generate nella matrice extracellulare (ECM) grazie alla connessione tra le adesioni focali e il citoscheletro.[28] Notevole importanza per la generazione dei segnali nelle cilia hanno le proteine di membrana policistina 1 e 2 e poliductina/fibrocistina (proteina legata allo sviluppo del rene policistico). Si ritiene che le cilia primarie siano espresse solo in presenza di uno shear stress particolarmente basso ed è stato ipotizzato che esse possano intervenire nello sviluppo dell'aterosclerosi.

Fisiologia[modifica | modifica wikitesto]

L'endotelio è un organo endocrino, paracrino e autocrino in grado di liberare una gran varietà di sostanze nel sangue o nello spazio interstiziale, le quali possono agire a distanza (attività endocrina), sulle cellule vicine (attività paracrina) o sulla stessa cellula endoteliale che le ha prodotte (attività autocrina). Le sostanze prodotte dall'endotelio comprendono composti vasoattivi, fattori di crescita, mediatori dell'infiammazione (citochine, chemochine), molecole adesive, molecole della sostanza extracellulare, prodotti del sistema emostatico, enzimi. Attraverso questa ampia gamma di composti l'endotelio interviene nel controllo dell'omeostasi vasale, dell'infiammazione, dell'immunità, dell'emostasi e svolge una serie di importanti funzioni metaboliche. Una delle dimostrazioni più eclatanti dell'importanza dell'endotelio si ricava dal fatto che l'applicazione dell'acetilcolina alla superficie intimale integra causa dilatazione del vaso, mentre dopo rimozione dell'endotelio l'applicazione provoca vasocostrizione. Questo apparente paradosso ha la sua spiegazione nel fatto che la vasodilatazione è determinata dall'azione dell'acetilcolina sull'endotelio, mentre la vasocostrizione è dovuta alla stimolazione diretta delle cellule muscolari lisce.

L'attività secretoria dell'endotelio è sia costitutiva (basale) che inducibile in risposta ai vari stimoli: per la sua posizione di interfaccia sangue/tessuto-parete vasale, l'endotelio è infatti in grado di rispondere ai cambiamenti del flusso, alle molecole plasmatiche, alle cellule ematiche e agli stimoli provenienti dall'ambiente subendoteliale.

Per la fisiopatologia dell'endotelio vedi voce Disfunzione endoteliale.

Permeabilità[modifica | modifica wikitesto]

L'endotelio continuo si comporta da barriera semipermeabile: limita il passaggio delle cellule ematiche e delle proteine plasmatiche, ma si lascia attraversare dai soluti di piccole dimensioni, verso i quali la permeabilità varia in base alla solubilità delle molecole nei grassi e nell’acqua e in base alla loro grandezza (raggio molecolare, Mr). Con l’eccezione della barriera emato-encefalica, gli endoteli continui non fenestrati sono liberamente permeabili all’acqua, ai soluti liposolubili e ai composti idrosolubili di piccole dimensioni, mentre sono attraversati con difficoltà dalle macromolecole.

Gli studi di fisiologia hanno dimostrato che gli endoteli continui si comportano come se possedessero due tipi di pori funzionali (teoria dei due pori):[29][30] “piccoli pori” di diametro di circa 8-10 nm (secondo Guyton il diametro è di 6-7 nm)[31] che consentono il passaggio esclusivamente ai soluti di piccole dimensioni di Mr <3 nm e “grandi pori” di diametro di circa 40-60 nm per il passaggio delle macromolecole di Mr >3.6 nm. Nei capillari dei muscoli scheletrici il rapporto tra il numero dei piccoli “pori” e quello dei grandi “pori” è di circa 4000:1.

Gli studi di microscopia elettronica hanno indicato, come equivalenti morfologici dei piccoli "pori funzionali", gli spazi intercellulari con i loro apparati giunzionali, mentre le caveole/vescicole non rivestite e i canali intracellulari (tubular-vesicular channels)[32], formati dalla sequenza di vescicole comunicanti tra loro, corrisponderebbero ai “grandi pori”.

Sulla base di queste evidenze si ritiene che il passaggio di acqua e di soluti attraverso l’endotelio avvenga lungo due vie: attraverso gli spazi (fessure) intercellulari (via paracellulare) o attraverso le cellule endoteliali stesse (via transcellulare).[33] Le sostanze di sufficiente liposolubilità, come ossigeno e anidride carbonica, sono in grado di attraversare direttamente la membrana plasmatica, per cui il loro passaggio avviene molto rapidamente per diffusione attraverso le cellule endoteliali. Le molecole idrosolubili di piccole dimensioni, con peso molecolare (p.m.) <40.000 daltons e Mr <3 nm, come acqua, monosaccaridi (glucosio, mannitolo, fruttosio), aminoacidi, urea e piccole proteine (mioglobina: p.m. 17.600 e Mr 2 nm), passano facilmente lungo la via paracellulare; la loro diffusione avviene velocemente, sebbene le fessure interendoteliali costituiscano soltanto l’1/1000 dell’intera superficie endoteliale. Le macromolecole di p.m. >60.000 e Mr >3.6 nm (emoglobina p.m. 68.000 e Mr 3,2 nm; albumina p.m. 69.000 e Mr 3.6 nm; HDL p.m. 180.000-360.000 e Mr medio 4.5 nm; IgM p.m. 950.000 e Mr 11.5 nm; LDL in media p.m. 2.300.000 e Mr 9-13 nm) in condizioni fisiologiche sono trasportate attivamente (con dispendio di energia) per la via transcellulare costituita dalle vescicole citoplasmatiche (transcitosi).[34] Poiché le vescicole responsabili della transcitosi hanno un diametro intorno ai 100 nm, le molecole di dimensioni particolarmente grandi (Mr >35-40 nm) non possono attraversare gli endoteli continui. Tale situazione si verifica per le lipoproteine di dimensioni maggiori (chilomicroni e lipoproteine a densità molto bassa o VLDL), mentre il prodotto del loro metabolismo, cioè le lipoproteine a densità intermedia (IDL, Mr 25-35 nm), mantengono la capacità di oltrepassare la barriera endoteliale. Ciò spiega perché l'iperchilomicronemia non rappresenti una condizione a rischio aterosclerosi.

Per le LDL esisterebbero due modalità di trasporto:[35] quella clatrina-mediata, che capta le LDL per le necessità metaboliche della cellula, e quella caveolina-dipendente, che le trasporta nello spazio subendoteliale: l'endocitosi clatrina-mediata utilizza il recettore per le LDL naturali LDLR ed è regolata dal fabbisogno cellulare di colesterolo; la transcitosi delle LDL da parte delle caveole è indipendente dal fabbisogno cellulare di colesterolo e può essere recettore-indipendente (endocitosi in fase fluida) o dipendente dallo scavenger-receptor SR-B1, che è in grado di legare sia le LDL modificate che quelle naturali.[34][36] Secondo Dallinga-Thie e Coll. la transcitosi delle lipoproteine potrebbe avvenire tramite le vescicole rivestite da clatrina.[37] Predrescu ha identificato un ulteriore sistema di trasferimento delle LDL che coinvolge l'esocitosi mediata dal recettore SNAP (SNARE).[38] Per quanto riguarda l’insulina, dai lavori finora pubblicati risulta che le cellule endoteliali aortiche trasportano l’ormone con un processo recettore-dipendente coinvolgente le caveole, mentre l’endotelio della microcircolazione utilizza le vescicole rivestite da clatrina.[39] L'acqua (p.m. 18 e Mr 0.12 nm) per il 60% filtra attraverso l'endotelio per via paracellulare, ma per il restante 40% utilizza la via transcellulare, servendosi però della via specifica costituita dalle proteine di membrana acquaporine.[29]

Grazie alla sua semipermeabilità, l'endotelio controlla la quantità e la composizione del liquido interstiziale presente nei tessuti, parete arteriosa compresa. Poiché il liquido interstiziale è il mezzo fisico che mette in comunicazione il sangue con le cellule dei tessuti, la permeabilità dell'endotelio svolge una funzione vitale per l'organismo, consentendo da una parte l'ingresso nei tessuti di ormoni e metaboliti e, dall'altra, la rimozione dei prodotti del catabolismo. La permeabilità è una funzione dinamica che viene modulata a seconda delle necessità fisiologiche e delle condizioni patologiche, come nel caso delle reazioni infiammatorie, nelle quali la permeabilità endoteliale aumenta enormemente. Infatti i mediatori dell’infiammazione, quali istamina, bradichinina e vascular endothelial growth factor (VEGF), legandosi ai propri recettori endoteliali, causano il riarrangiamento delle giunzioni intercellulari, cosicché le macromolecole possono facilmente attraversare l’endotelio per la via paracellulare. Anche nei tumori i capillari e le venule sono iperpermeabili alle macromolecole a causa della secrezione di citochine tumorali (es. VEGF).

Particolare importanza ha il passaggio dell’albumina attraverso l’endotelio. Poiché l’albumina è la più abbondante proteina plasmatica, la sua corretta filtrazione è essenziale per il mantenimento della pressione colloido-osmotica nello spazio extravasale (circa il 60% dell’albumina totale si trova nello spazio interstiziale). Il suo attraversamento della barriera endoteliale avviene per transcitosi recettore-dipendente. Il trasporto ha inizio con il legame dell’albumina alla glicoproteina gp60 (albondina o albumin-binding protein) presente nelle caveole. Dal momento che l’albumina plasmatica è il veicolo per il trasporto nel sangue di numerose sostanze insolubili in acqua, con la transcitosi dell’albumina vengono trasportati anche composti come vitamine liposolubili, acidi grassi a catena lunga e ormoni steroidei.

Per le forze che determinano il movimento di acqua e soluti attraverso l'endotelio vedi Scambi capillari e Equazione di Starling.

Via Transcellulare[modifica | modifica wikitesto]

Le macromolecole attraversano l'endotelio per transcitosi, processo che è mediato dal sistema delle caveole-vescicole non rivestite e dal sistema vescicolo-vacuolare VVO (vesiculo-vascuolar organelles).

Come descritto in Anatomia microscopica, le caveole sono invaginazioni della membrana plasmatica ("fossette") di circa 50-100 nm di diametro che si trovano in corrispondenza della superficie luminale, basale e laterale. La membrana delle caveole contiene caveolina-1 e cavina ed è ricca di colesterolo. L’apertura delle caveole nella membrana plasmatica avviene attraverso orifici (stomi) che sono di solito chiusi da sottili diaframmi di 6-8 nm di spessore, contenenti la proteina PV1 (plasmalemmal vesicle protein-1).[40][41] Oltre alla funzione di trasporto transcellulare, le caveole hanno grande importanza nel metabolismo del colesterolo, nella generazione di segnali intracellulari (es. in risposta allo shear stress e al fattore di crescita VEGF) e nella sintesi dell'ossido di azoto (NO).

Sebbene le caveole siano ritenute il più importante sistema di trasporto per le macromolecule, nelle venule post-capillari sono presenti grappoli di centinaia di grandi vescicole caveolina-1 positive di diametro variabile da 80 nm a 140 nm che sono indicati come VVO. Come nel caso delle caveole, le vescicole del VVO sono collegate sia le une alle altre sia alla membrana plasmatica tramite orifici che possono essere aperti o chiusi da diaframmi. È opinione diffusa che il VVO sia costituito dalla fusione delle caveole. Il VVO attraversa completamente il citoplasma della cellula endoteliale dalla superficie luminale a quella basale, formando canali transcellulari, ma può aprirsi anche nelle fessure intercellulari.[42]

Via Paracellulare[modifica | modifica wikitesto]

La via paracellulare coinvolge le fessure interendoteliali: questi spazi hanno un'ampiezza di circa 15-20 nm e una lunghezza di 0,15-1,5 mm e sono attraversati, e ristretti, dalle giunzioni occludenti (tight junctions), in corrispondenza delle quali lo spazio intercellulare si riduce a soli 4 nm di diametro. Tuttavia, con eccezione della barriera emato-encefalica, le giunzioni occludenti delle cellule endoteliali non formano una fascia isolante continua, lungo tutto il contorno della cellula (come negli epiteli), ma sono organizzate in segmenti discontinui e non allineati, disposti cioè ad altezze diverse sulla parete laterale delle cellule endoteliali.[43][44] Da questa disposizione delle giunzioni intercellulari, risulta che le discontinuità formerebbero dei percorsi tortuosi e troppo ampi per costituire un filtro efficace alla diffusione dei soluti. In una ricostruzione tridimensionale, alle discontinuità è stata attribuita un’ampiezza di circa 22 nm e una lunghezza di 40-90 nm.[45] La funzione di filtro poroso sarebbe quindi svolta dalle glicoproteine di membrana che occupano le fessure interendoteliali ("teoria della matrice di fibre" di Curry e Michel).[45] Pertanto la barriera alla diffusione viene attualmente identificata nel glicocalice che riveste sia la superficie endoteliale che le fessure intercellulari (“modello glicocalice-fessure"): la porosità del glicocalice rappresenterebbe così i “piccoli pori” dei fisiologi.[46] Ciò permette di spiegare perché la rimozione delle proteine o della sola albumina (che partecipa alla formazione dello strato endoteliale superficiale, ESL) dall'ambiente aumenta la permeabilità della barriera endoteliale.[47]

Per le forze fisiche che regolano il passaggio attraverso i capillari vedi le voci Scambi capillari e Equazione di Starling.

Controllo del tono vasale[modifica | modifica wikitesto]

Il tono vasale è controllato dal sistema nervoso, da ormoni, da sostanze vasoattive plasmatiche e tessutali e da mediatori prodotti dall’endotelio. L’endotelio svolge un ruolo fondamentale nel controllo della funzionalità delle arterie, delle vene e del microcircolo.La secrezione endoteliale è modulata dalle forze emodinamiche e da una varietà di sostanze circolanti. Le cellule endoteliali possiedono, infatti, un apparato recettoriale in grado di essere attivato dalle variazioni di flusso (shear stress) e da un ampio spettro di sostanze chimiche (ormoni, mediatori dell’infiammazione, endotossine batteriche, LDL ossidate, ecc.). Il controllo della muscolatura vasale viene esercitato dall'endotelio attraverso tre modalità: attività enzimatica su substrati plasmatici (es. enzima convertitore dell'angiotensina), secrezione paracrina (locale) di numerose sostanze vasoattive solubili, accoppiamenti diretti con le cellule muscolari lisce tramite le giunzioni comunicanti mio-endoteliali. In generale, i mediatori vasodilatatori possiedono anche azione anti-proliferativa, anti-trombotica e anti-aterogena, mentre le sostanze vasocostrittrici hanno azioni opposte.[48] In condizionioni patologiche, l'eccessiva produzione di radicali liberi sposta l'equilibrio verso la prevalenza delle sostanze vasocostrittrici/pro-aggreganti piastriniche.

Sulla base della loro natura chimica i mediatori vasoattivi endoteliali possono essere classificati in: composti lipidici (eicosanoidi; fattore attivante le piastrine, PAF), peptidi (endotelina-1, ET-1; angiotensina II, ATII; fattore di crescita di derivazione piastrinica, PDGF; peptide natriuretico, NP), di-nucleotidi (uridin-adenosin-tetrafosfato, UP4A), composti inorganici (ossido di azoto, NO; radicali liberi dell'ossigeno, ROS; acido sulfidrico, H2S; ioni K+).

Mediatori derivati dall'acido arachidonico

L'acido arachidonico (acido grasso polinsaturo a 20 atomi di carbonio), liberato dai glicerofosfolipidi di membrana per azione della fosfolipasi A2 in risposta a citochine e peptidi, è una delle più importanti fonti di metaboliti vasoattivi. Da esso derivano numerosi eicosanoidi (dal greco eikosi, venti, e eidos, forma): prostanoidi, leucotrieni e lipossine, che sono ormoni locali (o autacoidi, dal greco autòs, se stesso, e àkos, rimedio). Questo acido grasso può infatti essere metabolizzato dalle ciclossigenasi (COX1 e 2), dalle lipossigenasi (LOX) e dalla epossigenasi (citocromo P450 monossigenasi, CYP450).

Metabolismo di AA e sintesi dei prostanoidi.

Dalle COX endoteliali derivano sei prostanoidi, cioè prostaglandine (PG) e trombossano (Tx):[49] PGI2 (prostaciclina) e PGD2 con attività vasodilatatoria e anti-aggregante piastrinica, PGH2, PGF2α e TxA2 ad azione vasocostrittrice e pro-aggregante e PGE2 ad azione variabile a seconda della concentrazione e del letto vasale. Questi mediatori esercitano le loro azioni interagendo sui recettori di membrana DP, EP, FP, IP e TP (recettore TxA2) accoppiati alle proteine G: DP, EP2, EP4 e IP aumentano l'AMP ciclico (AMPc), mentre TP, EP1 e FP innalzano il calcio intracellulare e EP3 riduce la concentrazione di AMPc. Per la loro capacità di ossidare substrati, le COX sono anche fonte di radicali liberi dell'ossigeno (anioni superossido, O2-). Dall'epossigenasi derivano gli acidi epossi-eicosa-trienoici (EET) e di-idrossi-eicosatrienoici (DHET) ad azione vasodilatatrice; azione analoga hanno gli acidi idrossi-eicosa-tetraenoici (HETE) derivati dalla 15-lipossigenasi endoteliale (15-LOX-1).[50] HETE e EET attivano i canali del K+ calcio-dipendenti delle cellule muscolari lisce, provocando iperpolarizzazione della muscolatura e rilasciamento vasale.

Un'altra principale fonte di composti vasoattivi è l'aminoacido L-arginina: dalla sua ossidazione in L-citrullina, ad opera delle nitrossido-sintetasi (NOS), deriva l'ossido nitrico (NO). Questo mediatore attiva, nelle cellule muscolari lisce, l'enzima guanil-ciclasi con formazione del secondo messaggero GMPc, in grado di indurre rilasciamento della muscolatura. NO è prodotto costitutivamente dalla nitrossido-sintetasi endoteliale (eNOS); nell'endotelio è presente anche la nitrossido-sintetasi inducibile (iNOS).

Mediatori vasodilatatori[modifica | modifica wikitesto]

Mediatori vasoattivi prodotti dall'endotelio

In condizioni fisiologiche, i principali mediatori vasodilatatori endoteliali sono NO (ossido nitrico), PGI2 (prostaciclina) e EDHF (endothelium-derived hyperpolarization factor ). Il loro ruolo è stato dimostrato negli uomini e negli animali in vivo, ex vivo in arterie isolate e in vitro in colture di cellule endoteliali, in condizioni basali e dopo stimolazione con agonisti o esposizione al flusso. L’aumento delle resistenze vasali totali e della pressione arteriosa media che si ottiene, in soggetti sani, dalla somministrazione di inibitori delle COX (es. indometacina), delle NOS (es. L-NMMA) e di EDHF (es. KCl) è a favore di un ruolo fisiologico di NO, PG e EDHF nel controllo del tono vasale. La produzione di questi composti è stimolata dallo shear stress e da numerosi agonisti ed è regolata in modo tale che il deficit di uno di essi viene compensato dall'iperproduzione degli altri.

EDHF, piuttosto che da un unico fattore, è costituito da un insieme di sostanze capaci di provocare iperpolarizzazione delle cellule muscolari lisce. EDHF viene infatti definito come il complesso di sostanze che causano la vasodilatazione che residua dopo somministrazione di inibitori di NOS e di COX e che è inibita dai bloccanti dei canali del K+ o dalle alte concentrazioni extracellulari di K+. Il termine EDHF probabilmente include derivati dell'acido arachidonico, peptidi, CO (monossido di carbonio), H2S (acido sulfidrico) e H2O2.[51] Risultati ottenuti nelle coronarie e nell'arteria mammaria interna umane identificano EET come un importante EDHF nell'uomo.[52] Un'altra via attraverso la quale le cellule endoteliali possono causare iperpolarizzazione della muscolatura vasale è quella delle giunzioni MEJ; in questo caso è il passaggio di ioni K+ direttamente dall'endotelio alla tonaca muscolare che causa iperpolarizzazione: l'iperpolarizzazione riduce l'ingresso di calcio (Ca++) nelle cellule muscolari lisce, attraverso i canali Ca-voltaggio dipendenti, e determina vasodilatazione.

Una serie di lavori nell’uomo e negli animali hanno dimostrato che l’importanza dei singoli mediatori vasodilatatori muta con il variare del calibro dei vasi: la vasodilatazione delle arterie elastiche e muscolari dipende principalmente da NO, mentre quella arteriolare è influenzata maggiormente da EDHF e PGI2.[53][54]

1) Ossido Nitrico (NO)[modifica | modifica wikitesto]
Endotelio e stress ossidativo

L'intervento di NO nel mantenimento del tono vasale basale nell'uomo è dimostrata dal fatto che l'inibizione della sintesi di NO con analoghi dell'arginina provoca un aumento della pressione arteriosa, aumento che viene annullato dalla somministrazione di L-arginina. In uno studio in soggetti sani normotesi, l'inibitore della NOS N-monometil-L-arginina (L-NMMA) ha determinato un aumento della pressione arteriosa media di 8-15 mmHg, mentre con l'inibitore N-nitro-L-arginina-metil-estere (L-NAME) l'aumento è stato di 10-23 mmHg; all'effetto tardivo sulla pressione arteriosa sembra partecipare l'attivazione simpatica dovuta all'inibizione della NOS del sistema nervoso centrale (nNOS).[55] Allo stesso modo i ratti con deficit genetico di NOS endoteliale (eNOS -/-) sono ipertesi. La sintesi di NO declina con l'età.[56] La compromissione della sintesi di NO nella disfunzione endoteliale è responsabile di un eccesso di vasocostrizione con un aumento del tono vasale, nonché di una diminuzione dell'attività anti-aggregante. In presenza di stress ossidativi, gli O2- interagiscono con NO inattivandolo e formando perossinitrito (ONOO), che è a sua volta un radicale libero.

2) Prostaciclina (PGI2)[modifica | modifica wikitesto]

Il principale mediatore vasodilatatore derivato dalle COX nelle cellule endoteliali umane è la prostaglandina bicilcica PGI2 (prostaciclina). La somministrazione di inibitori delle COX (indometacina) in volontari sani ha provocato un aumento delle resistenze vasali totali (+20%) e della pressione arteriosa media (+10 mmHg),[57] mentre l'infusione di acido acetilsalicilico nell'arteria brachiale ha determinato una riduzione del 32% del flusso sanguigno dell'avambraccio: la riduzione del flusso ematico brachiale si accompagna ad una diminuzione della concentrazione del principale catabolita della PGI2, la 6-keto-PGF1α.[58] L'infusione di PGI2 negli animali anestetizzati (cane, ratto, coniglio) causa ipotensione, sia che la somministrazione venga fatta per via endovenosa che endoarteriosa, poiché la PGI2, a differenza delle altre prostaglandine, non viene metabolizzata nel polmone; la sua perfusione in cuori isolati induce dilatazione delle arterie coronarie. La PGI2 è la più abbondante prostaglandina prodotta dall'endotelio: la sua concentrazione è 10-100 superiore a quella delle altre prostaglandine endoteliali, ma declina con l'età. Si tratta di una delle più potenti sostanze vasodilatatrici dell'organismo, con un effetto circa 8 volte maggiore della PGE2, tanto che la prostaciclina sintetica (epoprostenol) e i suoi analoghi (iloprost e treprostinil) sono impiegati per il trattamento dell'ipertensione polmonare. Sebbene la PGI2 a concentrazioni fisiologiche abbia azione vasodilatatrice, ad alte concentrazioni essa acquista modeste proprietà vasocostrittrici; il diverso comportamento è in relazione ai differenti recettori muscolari attivati: IP nel primo caso, TP nel secondo. La stimolazione del recettore IP causa l'attivazione della proteina Gs e l'aumento di AMPc nelle cellule muscolari lisce, con conseguente rilasciamento per iperpolarizzazione da apertura dei canali K+ ATP-dipendenti. La delezione del gene IP nei topi si accompagna a ipertensione e diminuzione dell'attività antiaggregante; al contrario, i topi con deficit genetico del recettore TP sono normotesi, ma hanno tendenza al sanguinamento.

La PGI2 è sintetizzata ad opera delle COX e poi della prostaciclina-sintetasi (PGIS). Sia la COX1 che la COX2 sono espresse nell'endotelio: la COX1 è espressa costitutivamente ed è prevalente in condizioni basali;[59][60] l'espressione della COX2 (COX inducibile) è incrementata da shear stress, citochine infiammatorie, mediatori piastrinici, endotossine batteriche, LDL ossidate, trombina e ipossia; la sua concentrazione risulta aumentata nell'endotelio che riveste le lesioni aterosclerotiche. Gli studi farmacologici con inibitori della COX2 e gli studi sperimentali su topi con deficit del gene Cox2 lasciano supporre che la produzione endoteliale di PGI2 sia dovuta principalmente all'attività della COX2, tuttavia rimangono dubbi su quale sia la COX maggiormente responsabile della formazione della PGI2 (vedi nota 1). La PGIS è estremamente sensibile all'inattivazione da parte del perossinitrito: in questo modo, situazioni di stress ossidativo determinano la deviazione della sintesi dei prostanoidi verso composti vasocostrittori/pro-aggreganti; contemporaneamente i radicali liberi aumentano la stabilità e il numero dei recettori TP.[61] In queste situazioni, l'induzione della COX2 tenta di compensare il deficit di PGI2.

Mediatori vasocostrittori[modifica | modifica wikitesto]

Gli studi sperimentali su preparati animali hanno osservato che alcuni vasi rispondono alla stimolazione con agonisti (es. acetilcolina, acido arachidonico) con la sintesi si sostanze vasocostrittrici e che la vasocostrizione è inibita dalla rimozione dell'endotelio. In particolare, questo fenomeno è stato riscontrato nelle vene femorali, polmonari e spleniche e nelle arterie basilari canine e nelle arterie e vene polmonari di coniglio.[62] L'importanza dei mediatori vasocostrittori si accentua con l'invecchiamento e in condizioni patologiche (es. ipertensione, diabete)[63] ed è stata accertata anche nell'uomo (vedi nota 2).

Le principali sostanze vasocostrittrici di derivazione endoteliale comprendono: prostanoidi (TXA2 e PGH2) e altri derivati fosfolipidici (fattore attivante le piastrine, PAF; isoprostani, iPG), peptidi (endotelina 1, ET-1; angiotensina II, ATII; fattore di crescita derivato dalle piastrine, PDGF), ROS (O-2 e H2O2) e di-nucleotidi (uridin-adenosin-tetrafosfato, UP4A). Sebbene gli endoperossidi ciclici (PGH2) siano composti instabili a breve emivita, essi tuttavia possono attivare il recettore TP e provocare vasocostrizione. ATII agisce sia come ormone sistemico che come autacoide locale. Gli isoprostani sono isomeri delle prostaglandine generati dalla perossidazione non enzimatica degli acidi grassi polinsaturi (es. acido arachidonico) presenti nei fosfolipidi di membrana. I ROS si formano durante l'attività delle COX (i ROS sono generati durante la sintesi di PGH2), nonché per azione di altri enzimi cellulari (es. NOS, NADPH ossidasi, xantina ossidasi); una volta prodotti, essi, e in particolare H2O2, sono in grado di indurre contrazione della muscolatura liscia vasale per azione diretta e indiretta (disattivazione di NO e stimolazione della sintesi di prostanoidi vasocostrittori) (vedi nota 3).

Funzioni endocrino-metaboliche[modifica | modifica wikitesto]

Metabolismo delle lipoproteine[modifica | modifica wikitesto]

L'intervento dell'endotelio sul metabolismo delle lipoproteine non si limita al trasferimento delle LDL (e del colesterolo) nel subendotelio, ma comprende anche l'attività della lipoproteinlipasi.[64] La lipoproteinlipasi è un enzima chiave del metabolismo delle lipoproteine. La sua azione consiste nella idrolisi (scissione per inserimento di una molecola di acqua nel substrato) delle lipoproteine ricche di trigliceridi: i chilomicroni, sintetizzati dalla mucosa intestinale durante il pasto, le lipoproteine a densità molto bassa (VLDL), sintetizzate dal fegato durante la fase di digiuno, e le particelle rimanenti (IDL). Queste proteine hanno la funzione di veicolare nel sangue i grassi, principalmente i trigliceridi (o triacilgliceroli), che sono insolubili in acqua, affinché essi possano essere trasportati ai tessuti. La lipoproteilipasi agisce liberando gli acidi grassi dai trigliceridi delle lipoproteine, cosicché essi possono attraversare l'endotelio e accedere agli spazi interstiziali. Le lipoproteinlipasi comprendono la lipoproteinlipasi endoteliale (presente sia nei capillari che nell'endotelio arterioso) e quella epatica. La prima è sintetizzata dalle cellule dei tessuti che la secernono negli spazi interstiziali, da dove viene endocitata (captata) dalle cellule endoteliali e trasportata sulla loro superficie luminale.[65] Una volta esposta sulla superficie endoteliale, la lipoproteinlipasi lega le liporoteine e promuove l'idolisi dei loro trigliceridi, determinando la trasformazione dei chilomicroni e delle VLDL nelle particelle rimanenti (IDL), che hanno un più basso contenuto lipidico. In questo processo interviene anche la proteina di membrana GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol HDL binding protein 1), che fornisce la piattaforma sulla quale vengono in contatto la lipoproteinlipasi e le lipoproteine plasmatiche. La lipoproteinlipasi che si trova a livello interstiziale concorre alla patogenesi dell'aterosclerosi (vedi Patobiologia dell'aterosclerosi).

Metabolismo dell'angiotensina[modifica | modifica wikitesto]

L’endotelio ha un ruolo determinante nella produzione dell’ormone angiotensina II (ATII), che rappresenta uno dei più potenti agenti che aumentano la pressione arteriosa: l’ATII è uno dei più potenti vasocostrittori e una delle più potenti sostanze sodioritentrici (sostanze che inducono il riassorbimento renale di sodio). Sulla superficie endoteliale è infatti esposto l’enzima convertitore dell’angiotensina (ACE), enzima coinvolto nella regolazione della pressione arteriosa.[66] L’ACE è un enzima (esopeptidasi) che catalizza la rimozione per idrolisi di residui dipeptidici carbossiterminali da substrati polipeptidici (dipeptidil-carbossipeptidasi). In particolare l’ACE idrolizza il dipeptide istidil-leucina dall’angiotensina I, fisiologicamente inattiva, formando l’octapeptide angiotensina II, biologicamente attivo. La conversione si verifica per la gran parte quando il sangue passa attraverso i polmoni, ma in grado minore avviene nelle altre parti dell’organismo. È stato dimostrato che circa il 100% dei capillari polmonari esprime l'ACE contro il 10-15% di quelli della circolazione sistemica.[67] L'ACE idrolizza anche la bradichinina, un peptide vasodilatatore, inattivandola.

L'ACE è una singola molecola polipeptidica inserita nella membrana plasmatica luminale delle cellule endoteliali. L'enzima possiede pertanto un dominio extracellulare, in cui risiede l'attività enzimatica, un dominio transmembranaceo e uno intracellulare, citoplasmatico. Un altro enzima di membrana, ACE secretasi, è in grado di scindere il dominio extracellulare dell'ACE, liberando così l'enzima in circolo.

Note[modifica | modifica wikitesto]

1. Produzione della PGI2 nell'endotelio. I lavori farmacologici e sperimentali che attribuiscono la produzione di PGI2 alla COX2 si basano sulla misurazione dei metaboliti urinari della PGI2 (6-ketoPGF1α). La validità dei metaboliti urinari della PGI2 come valutazione indiretta della produzione di PGI2 è stata però messa in dubbio da alcuni autori, i quali sostengono che le concentrazioni urinarie di 6-ketoPGF1α riflettano principalmente la produzione di PGI2 a livello renale e/o vescicale piuttosto che la produzione endoteliale sistemica. Neanche gli studi in vitro ed ex-vivo hanno permesso finora di chiarire il problema. Le cellule endoteliali umane di vena ombelicale e di aorta in coltura esprimono, in condizioni basali, soltanto COX1; dopo esposizione, fino a 24 ore, al flusso unidirezionale viene espressa anche la COX2, mentre l'esposizione di cellule endoteliali aortiche di maiale ad uno shear stress prolungato per 7 giorni non determina alcun aumeto della COX2: rimane pertanto sconosciuto l'effetto sulla espressione della COX2 da parte di un flusso continuo e prolungato come si ha nel vivente. Nell'aorta di topo isolata, le tecniche immunologiche hanno consentito di rilevare, sia in condizioni basali che dopo stimolazione con uno ionoforo del calcio, un'immunoreattività notevole per la COX1 e scarsa per la COX2, mentre la misurazione della 6-ketoPGF1α del vaso poteva essere abolita dagli inibitori non selettivi della COX (diclofenac), ad indicare una prevalente produzione di PGI2 da parte della COX1. Secondo Félétou, alla produzione di PGI2 partecipano sia COx1 che COX2: nell'endotelio la COX2 sarebbe espressa costiutivamente, ma viene ulteriormente indotta da stimoli quali lo shear stress. Il problema è reso ancora più complicato dall'esistenza di possibili differenze funzionali tra endotelio venoso e arterioso.

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2. In condizioni patologiche, come l'ipertensione essenziale, la stimolazione delle arterie con acetilcolina induce la sintesi COX-dipendente di mediatori vasocostrittori. L'infusione di acetilcolina nell'arteria brachiale di soggetti normali provoca una vasodilatazione con aumento del flusso ematico brachiale; l'aumento di flusso è in gran parte legato alla produzione di ossido nitrico (NO), dal momento che esso è fortemente attenuato dagli inibitori della nitrossido sintetasi (NOS), ma non è modificato dagli inibitori della ciclossigenasi (COX). Nei soggetti con ipertensione essenziale, l'infusione di acetilcolina è seguita da un aumento ridotto del flusso ematico brachiale. In questi soggetti gli inibitori della NOS non modificano la risposta all'acetilcolina, mentre gli inibitori della COX si accompagnano ad un aumento del flusso. Queste risposte indicano che nell'ipertensione essenziale la sintesi endoteliale di NO è compromessa, mentre dalla COX hanno origine sostanze vasocostrittrici.

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3. H2O2 è in grado di diffondere dalle cellule endoteliali e di penetrare nella membrana cellulare delle cellule muscolari lisce, dove ossida i fosfolipidi di membrana, specialmente gli acidi grassi polinsaturi in posizione 2, come l'acido arachidonico. L'alterazione della membrana cellulare si accompagna ad un aumento dell'ingresso di Ca+2, con conseguente stimolazione della proteinchinasi C (PKC) citoplasmatica, nonché all'attivazione dei normali meccanismi di riparazione del danno ossidativo della membrana. Questi ultimi sono rappresentati dalle fosfolipasi A2 (PLA2), che hanno lo scopo di rimuovere i fosfolipidi ossidati, sostituendoli con molecole integre. I fosfolipidi liberati dalle PLA2 divengono substrato per la sintesi di mediatori vasocostrittori.

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Bibliografia generale[modifica | modifica wikitesto]

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