Virus di Epstein-Barr
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| Classificazione scientifica | ||||||||||||
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malattia del bacio |
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Indice |
[modifica] Introduzione
Già dal 1958 era nota una particolare forma di linfoma che colpiva le zone malariche africane sub-sahariane: il linfoma di Burkitt (BL). Nel 1964 Michael A. Epstein e Yvonne Barr, isolando una linea cellulare continua proveniente da BL e analizzando le cellule mediante micrografia elettronica, scoprirono la presenza di un nuovo herpesvirus che fu chiamato in loro onore: virus di Epstein-Barr (EBV). La presenza del virus non è limitata all’Africa, anzi è diffusissimo nella popolazione mondiale e persiste per tutta la vita nella maggior parte degli individui infettando i linfociti B. Nel 1968 si scoprì che EBV era l’agente eziologico della mononucleosi infettiva. Un anno più tardi si scoprì che questo virus era in grado di immortalizzare linfociti in coltura e di causare tumori anche in primati non umani. EBV è uno dei virus maggiormente associato ai tumori.
[modifica] Caratteristiche del virus di Epstein Barr
EBV appartiene alla famiglia degli herpesvirus, sottofamiglia gammaherpesvirus. La caratteristica peculiare di questa famiglia di virus è la possibilità di latentizzare in seguito all’infezione primaria. A distanza di tempo, specialmente negli individui immunocompromessi, l’infezione si può riattivare determinando patologie che si manifestano in maniera differente rispetto all’infezione primaria. Ha una forma sferoide ed è formato da una doppia membrana lipoproteica, il tegumento, che riveste un capside icosaedrico (100-110 nm di diametro) composto da 150 esoni e 12 pentoni. Il capside racchiude l’acido nucleico. Tra il capside e il rivestimento è situato uno strato amorfo detto tegumento. EBV ha un tropismo ristretto ai linfociti B, T e alle cellule epiteliali dei primati. Sull’envelope sono presenti due importanti glicoproteine gp325 e gp42; Queste legano rispettivamente CD21 e le molecole di classe II (antigeni leucocitari umani HLA) mediando l’internalizzazione del virus nei linfociti B. L’infezione di altri tipi di cellule è molto meno efficiente e avviene attraverso vie ancora poco conosciute. Più del 90% della popolazione umana con più di venti anni di età è sieropositiva. Il genoma di EBV, isolato da particelle virali, è una molecola lineare di DNA a doppio filamento di 172 kbp. Codifica circa cento geni dei quali durante la latenza ne vengono trascritti al massimo 11 di cui 9 tradotti. Il genoma è caratterizzato dalla presenza di diverse sequenze ripetute, alcune localizzate altre intersperse. L’intero genoma si localizza generalmente nei linfociti proliferanti in forma episomiale, ma sono documentati anche casi di integrazione. La mappatura del genoma di EBV è stata effettuata utilizzando l’endonucleasi di restrizione Bam HI.
[modifica] EBV, un virus oncogenico
È ormai noto il contributo dell’infezione virale alla patogenesi di molti tumori. Diversi tipi di papilloma umano (HPV), sono associati al tumore della cervice uterina (Durst et al., 1983). Il retrovirus umano della leucemia a cellule T di tipo 1 (HTLV-1) è associato alla leucemia/linfoma dei linfociti T. Anche il virus erpetico Simplex (HSV) contribuisce alla patologia di alcuni tumori orali (Nahmias et al., 1970). Il virus dell’epatite B è strettamente associato al carcinoma epatico (Nagaya et al.,1987). È anche risaputo che il processo della tumorigenesi è multifattoriale. I virus da soli non sono sufficienti ad indurre i tumori in quanto sono necessari anche diversi fattori ambientali e genetici. In generale i virus possono contribuire allo sviluppo dei tumori umani tramite due meccanismi non in contrapposizione. Il primo avviene tramite la stimolazione della proliferazione cellulare determinata da un’attivazione anomala di oncogeni o dal silenziamento della funzione degli oncosoppressori. Il secondo avviene grazie all’immunosoppressione, in cui si può avere l’insorgenza di tumori non correlati al virus che ha determinato la soppressione del sistema immunitario (come l’HIV). Anche il virus di Epstein-Barr è potenzialmente oncogenico ed è stato correlato a numerose malattie come il linfoma di Burkitt (BL), il carcinoma nasofaringeo (NPC), il morbo di Hodgkin (HD), il disordine linfoproliferativo legato all’X (XLP), il linfoma diffuso a cellule B grandi (DLBCL), il linfoma alle cellule T periferiche (PTL), il carcinoma gastrico ed i linfomi delle effusioni primarie (PEL). EBV rappresenta un grosso problema anche nei malati di AIDS dove è associato a diffusi linfomi policlonali, polmonite interstiziale linfocitica, leucoplachia della cavità orale. Linfomi di Burkitt EBV positivi si stanno osservando con sempre maggior frequenza nei pazienti che dopo il trapianto ricevono terapia immunosoppressiva. In un individuo sano, lo stato latente dell’infezione di EBV è sorvegliato dall’immunità umorale, dai linfociti T citotossici e del sistema dell’interferone (IFN) (Jabs et al., 1996).
[modifica] Proteine di EBV e il loro ruolo nella trasformazione tumorale
I numerosi studi condotti sul potenziale trasformante di EBV riguardano la capacità del virus di provocare in vitro la proliferazione indefinita dei linfociti, processo denominato immortalizzazione. La linea cellulare così ottenuta è chiamata linea cellulare linfoblastoide (LCL) (Pope et al., 1968). Le LCL crescono indefinitamente in coltura sotto il controllo delle proteine virali: sei antigeni nucleari (EBNA 1-6), tre proteine di membrana (LMP1-2A-2B) (Rickinson e Kieff, 1993) e gli RNA non poliadenilati (EBER1 ed EBER2). Diverse combinazioni di queste proteine determinano tre programmi di latenza virale.
EBNA1 È L’unica fra le proteine di EBV che accomuna tutti e tre i programmi di latenza e di conseguenza assumerà un ruolo cruciale nel suo mantenimento. EBNA1 è una fosfoproteina di 69-94 kD (641 amminoacidi) caratterizzata da una ripetizione interna di glicina-alanina che occupa il 30% della lunghezza della sequenza primaria. È codificata dal modulo aperto di lettura (ORF) BKRF1 nel frammento del genoma virale BamH1 K. Il trascritto proteico può essere generato dai promotori Cp/Wp oppure Qp in funzione del tipo di programma di latenza attuato. Si lega sotto forma di dimero a delle sequenze palindromiche del DNA denominate Ori P, le origini di replicazione dell’episoma virale (Yates et al., 1985). EBNA1, legandosi ad Ori P, ha la funzione di mantenere la replicazione dell’episoma e di associarsi ai cromosomi della cellula ospite durante la mitosi mantenendo la corretta segregazione degli episomi nei nuclei della progenie.
EBNA2 È codificata dall’ORF BYRF1 nel frammento del genoma BamH1 Y, dai promotori Cp o Wp (Alfieri et al., 1991; Allday et al., 1989; Moss et al., 1986; Rooney et al., 1989). EBNA2 (81-95 kD) è una delle prime proteine ad essere espressa dal genoma virale (insieme ad EBNA5) subito dopo l’ingresso del DNA nel nucleo di un linfocita B (Alfieri et al., 1991; Allday et al., 1989; Moss et al., 1986). Gioca un ruolo chiave nella regolazione della trascrizione virale e cellulare ed è un attivatore trascrizionale essenziale per l’inizio e il mantenimento della trasformazione del linfocita B (Hammerschmidt & Sugden, 1989); ceppi virali EBNA2 negativi (P3HR1) non immortalizzano i linfociti B (Miller et al., 1974). EBNA2 è un transattivatore trascrizionale sia di geni virali come LMP-1, 2A e 2B, EBNA1,3,4,6 che di geni cellulari come CD21 (il recettore di EBV) e CD23. EBNA2 è una molecola adattatrice che lega proteine cellulari che riconoscono specifiche sequenze di DNA come RBP-Jk (Jk recombination signal-binding protein nota anche come CBF1) (Hernkel et al., 1994). Questa proteine ingaggia il complesso della RNA polimerasi II. È stato anche dimostrato che EBNA2 fosforilato lega l’omologo umano del complesso SWI-SNF di lievito. Il complesso SWI-SNF partecipa alla regolazione genica mediante l’alterazione della configurazione nucleosomiale e potrebbe essere un componente dell’oloenzima RNA polimerasi II. L’interazione EBNA2-SWI-SNF supporta l’ipotesi che EBNA2 faciliti la transattivazione trascrizionale agendo come una molecola adattatrice della trascrizione. (Wu et al., 1996) Ulteriore conferma della capacità di EBNA2 di regolare la trascrizione è la sua capacità di interagire con il complesso p300 (Wang et al., 2000). Questo complesso contiene domini con attività acetil trasferasica (HAT domain). L’espressione di p300 aumenta drasticamente in seguito ad infezione con EBV. EBNA2 colocalizza con p300 nel nucleoplasma ma in siti diversi rispetto alla sua colocalizzazione con RBP-Jk. Ciò dimostra che è possibile attribuire ruoli differenti queste due interazioni (Bandobashi et al., 2001). EBNA2 può attivare la trascrizione: EBNA2 compete col complesso di repressione SMRT-SIN3A-HDAC1e2 nel legame con RBP-Jk (figura 1.3c-A). Questo complesso grazie all’attività deacetilasica di HDAC1e 2 inibisce la trascrizione. Una volta spiazzato il complesso di repressione, EBNA2 può reclutare i fattori basali per l’attivazione della trascrizione. EBNA6 può competere per il legame con RBP-Jk contendendolo con EBNA2.
EBNA5 o EBNA LP Di lunghezza variabile da 20 a 130 kD è la prima proteina insieme ad EBNA2 che viene trascritta nei linfociti B infettati ed è anch’essa importante nella trasformazione dei linfociti B. Deriva dagli esoni ripetitivi W1 e W2 che si trovano nell’ unita maggiore di sequenze interne ripetute (IR1) e dagli esoni unici Y1 e Y2 a valle di IR1 (Bodescot et al., 1984). La porzione ammino-terminale della proteina contiene delle sequenze ripetitive e da esse dipendono le variazioni del peso molecolare che va da 20 a 130 kD (Fincle et al., 1987). EBNA2 e EBNA5 insieme inducono l’espressione della ciclina D2 (Sinclair et al., 1994) e la trascrizione di LMP1 e 2B (Harada and Kieff, 1997). È stato osservato che EBNA 5 si lega ai geni oncosoppressori p53 e Rb (Szekely et al., 1993).
EBNA 3, 4 e 6 (3A, 3B, 3C) Sono codificate da ORF BERF1,2,3 ed il loro peso molecolare è rispettivamente 140, 160 e 155 kD. L’espressione di EBNA3 ed EBNA6 è indispensabile per l’immortalizzazione della cellula B (Tomkinson et al., 1993), mentre EBNA4 non lo è ma è in grado di regolare positivamente l’espressione di Bcl-2 (Sillins e Sculley, 1995). EBNA6, come EBNA2, lega RBP-Jk sia in vivo che in vitro (Robertson et al., 1995 & 1996): questa osservazione suggerisce che EBNA6 compete con EBNA 2 nel legame con RBP-Jk. Questa competizione è supportata dalla scoperta che l’espressione transiente di EBNA6 moduli negativamente la transattivazione mediata da EBNA2 dei promotori di LMP1 e LMP2A (Le-Roux et al., 1994) (Marshall et al., 1995). Altri dati in letteratura suggeriscono che EBNA 6 (codificata da BamHI E/e1/e2) regoli direttamente l’espressione di CD21 se transfettata in linee BL EBV negative (Wang et al., 1990). Insieme questi dati suggeriscono che EBNA2 ed EBNA6 cooperano durante l’immortalizzazione dei linfociti B in vari modi: competendo per gli stessi fattori cellulari e modulando l’espressione di geni bersaglio condivisi (Subramanian et al., 2002).
LMP1 È una delle proteine più studiate di EBV. Viene trascritta dall’ORF BNLF1 nel frammento Bam H1Nhet che si trova all’estremità destra del genoma virale lineare e viene trascritto nella direzione opposta rispetto agli EBNA. Strutturalmente è una proteina trans-membrana di 63 kD con le estremità amminica e carbossilica rivolte nel citoplasma (Mann et al., 1985) e separate da una regione idrofobica a sei segmenti che attraversano la membrana cellulare. La lunga coda al C-terminale costituisce la parte effettrice della proteina (Farrell, 1998). Essa interagisce con dei fattori associati al recettore del TNF (tumor necrosis factor) denominati TRAF e con la proteina del dominio di morte associata al recettore di TNF (TRADD) (Devergne et al., 1996). Queste regioni di interazione sono richieste per l’immortalizzazione dei linfociti B e per l’attivazione della via di trasduzione del segnale mediata da NF-kB (Izumi & Kieff, 1997). LMP1 è un omologo funzionale di CD40: entrambe agiscono sulle stesse vie di trasduzione del segnale che regolano sia i segnali di morte che di proliferazione. La figura 1.3d mostra queste correlazioni fra le due proteine (JAK3: kinasi Janus-attivata 3; STAT: segnali trasducenti e attivatori della trascrizione; AP.1: proteina 1 attivatrice; JNK: kinasi c-Jun terminale; IKK: kinasi inibitrice di κB; NIK: kinasi che induce NF-κB; RIP: proteina per l’interazione col recettore). (Thorley-Lawson 2001) LMP1 si associa con la proteina del citoscheletro vimentina ed è fosforilata sui residui di serina nell’estremità carbossilica. La sua emivita è di 3-4 ore (Mann e Thorley-Lawson, 1987 ; Baichwal e Sugden, 1987; Moorthy et al., 1993). LMP1 è una proteina oncogenica ed è essenziale per la trasformazione in vitro dei linfociti B in cellule linfoblastoidi (Cuomo et al., 1992; Kaye et al., 1993). Inibisce l’apoptosi delle cellule B inducendo bcl-2 (Henderson et al., 1991) e A20 (Fries et al., 1996). Inoltre è stato dimostrato il ruolo oncogenico di LMP 1 in studi effettuati in topi transgenici. Questi topi hanno sviluppato dei linfomi alle cellule B (Kulwichit et al., 1998).
LMP2A e 2B Sono proteine transmembrana di 53 e 40 kD rispettivamente (Longnecker et al., 1991). Non sono essenziali per la trasformazione di cellule B in vitro. Sono diverse nel primo esone al 5’ ma condividono gli stessi 8 esoni all’estremità 3’ (Laux et al., 1989). Il promotore di LMP2B è situato nel primo intorne di LMP2A. Entrambe possiedono un dominio idrofobico trans-membrana, costituito da 12 segmenti, che termina nel citoplasma con una breve coda (Sample and Kieff., 1990). In più LMP2A ha un dominio N-terminale nel citoplasma contenente le sequenze ITAM (immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) (Alber et al., 1993). Queste sequenze sono presenti anche nei co-recettori Igα e Igβ del BCR (recettore delle cellule B) che trasmettono segnali di attivazione dopo la stimolazione del recettore. I domini ITAM di LMP2A e dei corecettori del BCR attivati legano entrambi le tirosin kinasi Lyn e Syk, ma LMP2A è sempre fosforilato e attivato, quindi lega costantemente Lyn e Syk. La cellula è quindi insensibile all’attivazione da parte dell’antigene in quanto l’attività di queste tirosin kinasi è ridotta poiché sono sequestrate da LMP2A. In questo modo LMP2A blocca la via di traduzione del segnale del BCR prevenendo il normale flusso di ioni calcio e l’accumulo delle protein kinasi fosforilate. Questa azione di LMP2A previene l’attivazione del ciclo litico di EBV (Miller et al., 1994, 1995) e dimostra quindi l’importanza di questa proteina di membrana nel mantenimento della latenza e quindi della persistenza del virus in individui sani. Mimare l’azione del BCR ha un ulteriore importante significato: nelle cellule infettate da EBV l’espressione di LMP2A porta a superare i normali controlli a cui viene sottoposto un normale linfocita B. Le cellule che non esprimono il BCR o che hanno un BCR non funzionale vanno incontro ad apoptosi. LMP2A fornisce un segnale di sopravvivenza a queste cellule poiché possiede un’attività basale di signaling (Caldwell et al., 1998). LMP2A agisce quindi come un surrogato del BCR; la figura 1.3e mostra il confronto fra queste due proteine (BLNK: B-cell linker protein; DAG: diacilglicerolo; IP3: inositolotrifosfato; PI3K: fosfatidil inositolo3-kinasi; PIP2 e 3: fosfatidilinositolo di e tri fosfato; PLC-γ2: fosfolipasi C-γ2; PKC: protein kinasi C; Yp: tirosine fosforilate). (Thorley-Lawson 2001).
EBER1 ed EBER2 Sono degli RNA non poliadenilati trascritti dalla RNA polimerasi III dal frammento genomico BamH1 A (Toczyski et al., 1994). Sono composti rispettivamente di 166 e 172 nucleotidi. Sono i trascritti virali più abbondanti in cellule con EBV in fase di latenza. Malgrado la loro abbondanza non sono necessari per la trasformazione dei linfociti B in vitro, ma è stato studiato il ruolo oncogenico in cellule di linfoma di Burkitt (Komano et al., 1999). Possono indurre la secrezione dell’interleuchina 10 (IL-10) che stimola la crescita delle cellule B infettate e sopprimere le cellule T citotossiche (Kitagawa et al., 2000).
[modifica] Programmi di latenza virali e relativo promotore utilizzato
In base all’espressione delle proteine virali e all’espressione dei marcatori di superficie cellulari, sono stati identificati tre tipi di latenza virale (Rowe et al., 1987).
La latenza I È caratterizzata dall’espressione di EBNA 1 dal promotore Q (Qp), degli EBER1,2 e di LMP2A (figura 1.4 A). In vivo EBV persiste per tutta la vita nelle cellule B della memoria di un portatore sano attuando programma di latenza I. In condizioni patologiche l’espressione dei tre geni suddetti caratterizza le biopsie di linfoma di Burkitt e le linee cellulari corrispondenti messe in coltura per tempi non prolungati. I linfociti di BL (linfoma di Burkitt) infettati con EBV con latenza I crescono in coltura come singole cellule, non esprimono marcatori di attivazione e molecole di adesione ma soltanto dei marcatori di differenziazione CD10 e CD77 e sono cellule del centro germinativo: centroblasti o centrociti ( Rowe et al., 1987).
La latenza II È caratterizzata dall’espressione di EBNA 1 dal promotore Q (Qp) e inoltre di LMP1, LMP2A, EBERs (figura 1.4 B). Può esserci anche l’espressione di LMP2B. La latenza II è stata osservata in HD, NPC, il linfoma nasale NK/T, e nei PEL. (Thorley Lawson 2000).
La latenza III Tutte e nove proteine della latenza EBV sono trascritte. EBNA 1-2-3-4-5-6 sono trascritti dal promotore Wp/Cp (figura 1.4 C). La trascrizione avviene con la formazione di un unico policistrone che viene successivamente maturato tramite splicing. L'utilizzo del promotore Cp/Wp è la condizione necessaria per definire la latenza III. La presenza di EBNA 2 è quindi prerogativa delle cellule infettate che mostrano latenza III. Tali cellule sono le linee linfoblastoidi (LCL) e alcune linee di linfoma di Burkitt (BL) in coltura prolungata. La latenza III viene anche riscontrata nelle linfoproliferazioni associate ad EBV nei soggetti immunocompromessi. Le cellule con latenza III presentano un fenotipo attivato perché esprimono i marcatori di attivazione CD23 ed alti livelli di molecole di adesione come CD11a, CD54, CD58, che sono associati all’espressione di MHC di classe I e alla formazione di aggregati cellulari nel mezzo di coltura.
[modifica] Malattie associate all’EBV
Più del 90% della popolazione umana è portatrice sana di EBV. L’infezione primaria è generalmente asintomatica nei bambini, patologica (IM) nel 50% dei casi negli adolescenti e negli adulti. L’infezione primaria avviene solitamente all’età di tre anni e il virus persiste per tutta la vita dell’ individuo in modo latente. Utilizzando la tecnica della PCR semiquantitativa (Miyashita et al., 1995) è stato stimato che il numero dei linfociti B infettati dal virus è una cellula per milione nel sangue periferico e rimane costante per tutta la vita di un individuo sano. EBV è anche associato a vari tumori. L’associazione del virus di Epstein-Barr con differenti tumori supera di gran lunga tutti gli altri virus umani. Nello stesso tempo però il virus non causa nessuna malattia nella maggioranza dei portatori. Questo apparente paradosso ci porta a concludere che tale pacifica coesistenza è dovuta all’interazione dell’immuno-sorveglianza dell’ospite con l’espressione delle proteine virali. (Klein, 1994).
Elenco delle principali delle malattie associate all'EBV
Linfoma di Burkitt (BL) Carcinoma nasofaringeo (NPC) Disordine linfo-proliferativo post trapianto(PTLD) Disordine linfoproliferativo associato all’X (XLP) Linfomi delle effusioni primarie Malattia di Hodgkin (HD) Linfoma diffuso a cellule B grandi (DLBCL) Carcinoma gastrico Sclerosi multipla
Il virus di Epstein-Barr viene principalmente trasmesso tramite la saliva, da qui penetra e si replica nelle cellule epiteliali del tratto orofaringeo (infezione primaria) e successivamente infetta i linfociti B ricircolanti (figura 1.5a). in seguito a ciò si può arrivare allo sviluppo della mononucleosi infettiva (IM). L’infezione primaria è spesso asintomatica nei bambini; nel 50% degli adulti porta invece a IM. La mononucleosi infettiva è caratterizzata da una immunosoppressione transiente e da una proliferazione dei linfociti B infettati che possono arrivare anche ad 1/10 dei linfociti B totali. In seguito l’aumento dei linfociti T citotossici (CD8+) contrasta la crescita delle cellule B. La risposta cellulare T contribuisce ai sintomi della mononucleosi e riesce nella maggioranza dei casi ad eliminare quasi tutti i linfociti in eccesso infettati dal virus. Tuttavia in alcune cellule, che esprimono pochissimi geni virali, il virus rimane per tutta vita. Questa fase viene detta di latenza. L’attuazione della latenza è tipica anche di altri herpesvirus (Cayrol and Flemington 1995; Cooper 1994).
