Titolazione virale

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La titolazione virale o saggio virale o conta virale è il conteggio, fatto in laboratorio, del numero di particelle virali presenti in un campione di un certo virus in analisi. Viene utilizzata sia nel campo della ricerca microbiologica sia nel campo della diagnostica e della produzione di vaccini antivirali, tutte situazioni che richiedono la conoscenza della quantità di virus in analisi o uso.

Possiamo distinguere le tecniche di titolazione virale in tecniche quantitative e qualitative. Le metodologie di titolazione quantitative mirano a verificare la presenza di un virus in un dato campione e ad identificare il numero di particelle virali in esso presenti. Le metodologie di titolazione qualitative invece mirano a verificare la presenza o l'assenza di determinati effetti del virus in un substrato cellulare sensibile.

Un'ulteriore distinzione può essere fatta tra tecniche tradizionali e moderne. Le prime, metodiche standardizzate già in uso da decenni ma generalmente lente e faticose, sono distinte in tecniche di titolazione fisica, biologica e sierologica. Le seconde, metodiche nuove e da poco in uso, sono tecniche che riducono notevolmente il tempo necessario alla titolazione, con una elevata specificità e sensibilità nella rilevazione del virus, ma che attualmente hanno un costo ancora elevato. Tra queste la più importante è la Reazione a catena della polimerasi (PCR, Polymerase Chain Reaction).

Titolazione fisica[modifica | modifica sorgente]

Foto di virioni del virus dell'influenza effettuata mediante microscopio a trasmissione.

La titolazione fisica è un metodo di titolazione quantitativo tradizionale. Si tratta di una metodologia molto indaginosa, che richiede l'uso di attrezzature complesse e costose, e quindi trova scarso uso ai fini diagnostici. Risulta invece fondamentale nell'ambito della ricerca. Infatti mentre le altre metodologie, quelle sierologiche in particolare, si basano su conoscenze già acquisite sulle caratteristiche epidemiologiche e patogene dei virus, mirando quindi alla semplice ricerca in un materiale contaminato di indizi della presenza di specie virali già note, la ricerca fisica del virione è una metodologia rivolta alla ricerca ed identificazione di specie virali sconosciute.

Ovviamente una nuova ed ignota specie virale, che presenti caratteristiche nuove o anomale, ma comunque capace di agire da patogeno, potrebbe non essere rilevabile con normali metodi di ricerca. In questo caso l'unico metodo certo di rilevare la presenza del virus è l'osservazione diretta delle particelle virali. Tuttavia a causa delle ridotte dimensioni dei virioni (10-300 nm), inferiori al massimo ingrandimento possibile con un microscopio ottico, è necessario l'utilizzo di microscopi più potenti (ingombranti e costosi), come il microscopio elettronico (a trasmissione o a scansione) ed il microscopio a fluorescenza in campo oscuro. Questi microscopi permettono di osservare direttamente particelle virali in sospensione all'interno di una goccia di soluzione e di apprezzare preliminarmente le caratteristiche morfologiche del virione (presenza del pericapside, di fibre, di peplomeri o altre strutture esterne, simmetria del capside, forma e dimensione del virione).

Non essendo possibile in questa prima fase di studio applicare le altre metodiche di titolazione, la ricerca fisica del virione può essere utilizzata per titolare il virus prendendo il nome di titolazione fisica. Il problema principale di questo metodo è che il campo di osservazione è molto limitato e solo una parte delle particelle virali contenute nel campione risultano visibili e possono essere contate. Per ovviare a ciò la soluzione di particelle virali a concentrazione ignota viene mischiata ad una soluzione a concentrazione nota di particelle di lattice o polistirene, le cui dimensioni molto superiori a quelle del virus le rendono facilmente riconoscibili. A questo punto un conteggio proporzionale delle particelle virali e delle particelle di lattice permette di risalire alla concentrazione iniziale della soluzione virale.

Titolazione sierologica[modifica | modifica sorgente]

Le tecniche di titolazione sierologica sono metodiche tradizionali che sfruttano la capacità del virus di interagire con le componenti del sangue, in particolare con gli eritrociti e con le immunoglobuline. La titolazione sierologica tramite Emoadsorbimento sfrutta la capacità di alcuni virus di produrre l'emoagglutinina mentre la titolazione sierologica tramite anticorpi antivirali specifici sfrutta la specificità antigenica delle immunoglobuline per le componenti del virione.

Saggio dell'emoadsorbimento[modifica | modifica sorgente]

Molti virus con envelope (orthomyxovirus, paramyxovirus, morbillo, parotite ed alcuni picornavirus) sono dotati di glicoproteine di superficie note come emoagglutinine. Queste sono importanti recettori virali capaci di legare residui di acido sialico sulla superficie cellulare e quindi dei promuovere sia il legame alla cellula bersaglio che l'emoagglutinazione.

Quando si inocula un virus emoagglutinante in una coltura cellulare, durante il ciclo replicativo le emoagglutinine vengono esposte sulla superficie delle cellule infette per essere incluse, assieme a parte della membrana cellulare, nel virione maturo. Quindi se si aggiungono emazie di una appropriata specie (solitamente di coniglio o di cavallo, ma anche di topi geneticamente ricombinati umanizzati) alle colture in cui il virus si sta replicando, queste si legheranno tenacemente alla superficie delle cellule infette, grazie alla particolatre ricchezza di acido sialico della superficie dei globuli rossi. Si è soliti definire questa proprietà delle colture infette di trattenere i globuli rossi come emoadsorbimento.

Sfruttando l'emoadsorbimento è quindi possibile rilevare la presenza di virus emoadsorbenti nella coltura inoculata già alcuni giorni prima della comparsa dell’effetto citopatico. L’identificazione può essere confermata con metodi d’inibizione dell’emoagglutinazione, inibizione dell’emoadsorbimento, o attualmente, più semplicemente, con l’immunofluorescenza.

Anticorpi antivirali specifici[modifica | modifica sorgente]

Gli anticorpi sono in grado di riconoscere in modo altamente specifico gli antigeni virali e pertanto possono essere usati per l'identificazione e la quantificazione delle particelle virali presenti in un campione. Le tecniche basate su anticorpi antivirali più utilizzate sono l'immunofluorescenza e le prove di inibizione.

Immunofluorescenza[modifica | modifica sorgente]

Prove di Inibizione[modifica | modifica sorgente]

Titolazione biologica[modifica | modifica sorgente]

Si basa sull'osservazione e la valutazione degli effetti biologici specifici prodotti dal virus in esame in un substrato sensibile, come colture cellulari, colture batteriche, cavie o uova embrionate di pollo. In particolare possiamo distinguere tra metodiche di titolazione biologica quantitative e qualitative. Le metodologie di titolazione quantitative mirano ad identificare il numero di particelle virali presenti nel campione mettendolo in relazione alla quantità degli effetti biologici che tali particelle sono in grado di produrre. Le metodologie di titolazione qualitative mirano invece a stabilire la minima quantità di particelle virali capaci di indurre l'assenza o la presenza di un determinato fenomeno nel substrato sensibile.

Saggio delle placche[modifica | modifica sorgente]

Questo metodo di titolazione biologica quantitativo si basa sull'idea che, infettando con un virus animale una coltura cellulare monostrato confluente o con un batteriofago una coltura batterica, la grandezza del focolaio di infezione sia proporzionale al numero di particelle virali che lo ha causato, ossia che maggiore è il numero di particelle virali infettanti inoculate più evidenti e numerosi saranno gli effetti citopatici rilevabili sulla coltura. Questo metodo è particolarmente utile per rilevare e saggiare quei virus in grado di lisare la cellula ospite e quelle che la circondano, producendo le tipiche placche di lisi.

Per la conta si procede infettando varie colture inoculando a ciascuna di esse un volume V della soluzione a concentrazione C ignota e avendo cura di agitare la provetta per spandere la soluzione su tutta la superficie. Prima dell’inoculo del virus va eliminato il terreno dalla coltura cellulare poiché questo contiene una grande quantità di liquido che influirebbe sulla diffusione delle particelle virali e quindi la si incuba a 37 °C per 45 minuti-1 ora, tempo che permette l'adsorbimento delle particelle virali ed è per questo detto tempo di adsorbimento. Teoricamente, se ogni virus presente nel volume V di soluzione infettasse una sola cellula, basterebbe contare il numero di cellule lisate, ossia che sono state infettate, per conoscere il numero di particelle virali N in essa presenti e ricavare facilmente la concentrazione virale C secondo la formula

C=\frac{N}{V}.


Tuttavia ciò non è possibile poiché normalmente all'interno dei campioni virali estratti da colture o animali infetti è presente un numero molto elevato di particelle virali, così che solitamente più di una infetta contemporaneamente una stessa cellula. Inoltre i nuovi virioni liberati dopo le infezioni primarie andrebbero a produrre per diffusione nuove infezioni su altre cellule anche a grande distanza, rendendo impossibile risalire al numero originale di particelle virali. Per ovviare a questi difetti vengono allora utilizzati due accorgimenti:

  • Vengono utilizzate soluzioni molto diluite della soluzione virale originale, in modo che l’inoculo contenga un numero di particelle virali notevolmente più piccolo rispetto al numero di cellule contenute nella coltura e quindi risulti molto improbabile che due particelle virali infettino la stessa cellula. Inoltre agitare la provetta e spandere la soluzione su tutta la superficie della coltura contribuisce ulteriormente a rendere meno probabile che le particelle virali infettino la stessa cellula o cellule vicine tra loro.
  • Vengono aggiunte sostanze gelatinose (solitamente gel di Agar agar) alla coltura che la rendono semisolida e impediscono alle nuove particelle virali di infettare cellule lontane dalla prima cellula infettata. Ne consegue che le infezioni secondarie si verificheranno solo nelle vicinanze della sede di infezione primaria e che per ogni particella virale iniziale otterrò una ed una sola placca di lisi sulla coltura. A questo punto le placche possono agevolmente essere colorate con vari metodi e contate.

Dato che la concentrazione della soluzione virale originale C è ignota non posso sapere quanto diluirla per ottenere inoculi adatti alla conta delle placche. Procedo quindi per tentativi infettando varie colture monostrato con un volume costante V di soluzioni a diluizione sempre maggiore.

Genericamente, se considero una soluzione a concentrazione iniziale c_0 e ne prelevo un volume v che diluisco con un volume d di solvente, la nuova concentrazione c_1 della soluzione diluita sarà

c_1=\frac{c_0\times v}{v+d}.

Se poi prelevo nuovamente dalla soluzione a concentrazione c_1 lo stesso volume v e lo diluisco sempre con un volume di solvente d, la nuova concentrazione c_2 della soluzione sarà

c_2=\frac{c_1\times v}{v+d}

o, sostituendo c_1,

c_2=\frac{c_0\times v^2}{\left ( v+d \right )^2}.

In generale la concentrazione c_n della soluzione ad n-esima diluizione della soluzione iniziale a concentrazione c_1 sarà

c_n=\frac{c_0\times v^n}{\left ( v+d \right )^n}=c_0\times\left (\frac{v}{v+d}\right)^n.

Nella pratica si è soliti prelevare un volume v = 0,1 ml e diluirlo con un volume d = 0,9 ml in modo che

\frac{v}{v+d}=\frac{0,1 ml}{0,1 ml+0,9 ml}=0,1=10^{-1}

e quindi la concentrazione c_n della soluzione ad n-esima diluizione sia

c_n=c_0\times 10^{-n}.

Da ognuna delle soluzioni diluite nell’ordine di 10^{-1} viene quindi prelevato un volume V che viene inoculato alla coltura per produrre le placche di lisi; le soluzioni a concentrazione maggiore produrranno i difetti descritti, rendendo impossibile la conta, mentre quelli a concentrazione adeguata permetteranno di contare le placche e risalire al numero originario di particelle virali presenti nell’inoculo a concentrazione c_n. Solitamente vengono prodotte colture infettate con diluizioni fino a 10^{-7} o 10^{-8} e tra queste vengono scelte per calcolare la concentrazione iniziale quelle che riportano un numero di placche compreso tra 50 e 70. Ciò perché, per ragioni statistiche, campioni diluiti troppo o troppo poco, e di conseguenza con un numero troppo piccolo o troppo grande di placche, ridurrebbero la sensibilità del metodo utilizzato. Per lo stesso motivo più colture sono infettate con inoculi a stessa diluizione, in modo di avere dei gruppi di controllo con cui confrontare i dati. In questo caso il numero reale di placche sarà considerato il numero medio di placche per coltura.

Quindi, posto P il numero medio di placche per coltura prodotte dall’inoculo di un volume V di una soluzione diluita n volte, la concentrazione di particelle virali di tale soluzione c_n è

c_n=\frac{P}{V}=c_0\times 10^{-n}.

Ne consegue che la concentrazione iniziale c_0 è

c_0=\frac{P}{V}\times 10^n.

Poiché nella pratica si è soliti inoculare volumi V di soluzione virale diluita nell'ordine del ml e di esprimere il numero di particelle virali in unità formanti placche (pfu, plaque forming units), inteso come l'equivalente numero di virioni necessari a formare una placca, la concentrazione di particelle virali può essere espressa in unità formanti placche per millilitro (pfu/ml).

Metodo della diluizione limite[modifica | modifica sorgente]

il metodo della diluizione limite è un metodo quantitativo. si parte dalla valutazione di un tampone (ad esempio: tampone di uno scolo nasale) che rappresenta il totale di virus presenti. quindi bisogna praticare una serie di diluizioni per ridurre il numero totale di virus e portarlo a concentrazione nota. le diluizioni saranno esponenziali su base logaritmica (partendo, quindi, da 10-1 fino ad almeno alla 10-7). questo significa che si partirà da un rapporto di 1:10 (1 parte di virus e 9 parti di diluente) e si arriverà a 1:10000000. ovviamente, è consigliabile allestire più pozzetti (circa 4), in maniera tale da avere un risultato quanto più preciso possibile. in ogni pozzetto si inserirà 50 μl di D-Mem (terreno), si diluirà il virus in maniera esponenziale e dopo un po' di tempo si aggiungono 100 μl di cellule. in seguito, si andrà a osservare gli effetti citopatici (se presenti). il titolo virale è la più alta diluizione del virus (cioè il più piccolo numero di particelle virali) in grado di infettare il 50% delle unità inoculate e corrisponde a 1 DOSE INFETTANTE CITOPATICA (DITC50).

Voci correlate[modifica | modifica sorgente]