Test di Ames

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Il test di Ames, ideato da Bruce Ames nel 1973 [1], è un test genetico per l'analisi della genotossicità di una sostanza, molto utilizzato ad esempio in ambito biomedico e farmaceutico-industriale nella fase preclinica di sperimentazione di nuove molecole e per analisi ambientali.

Principio del test[modifica | modifica wikitesto]

Il principio del test si basa sulla valutazione della capacità di un sospetto mutageno di provocare la reversione di un carattere auxotrofo his- in un ceppo di batteri mutato (Salmonella typhimurium), rendendolo nuovamente capace di sopravvivere in un terreno privo di istidina. La maggior parte dei ceppi di Salmonella utilizzati nel test presentano anche altre mutazioni che alterano la permeabilità della parete (rfa-, elimina la catena polisaccaridica dei lipopolisaccaridi di membrana), consentendo l'ingresso nel batterio di mutageni anche di grosse dimensioni, o eliminano l'azione dei meccanismi di riparo del DNA (ΔuvrB, delezione del gene uvrB), permettendo in tal modo il mantenimento delle mutazioni ottenute. Poiché l'assenza di meccanismi di riparo rende complessa la crescita del batterio, in molti casi si introduce nel ceppo il plasmide pKM101, contenente i geni per il sistema di riparo SOS del DNA, incline a commettere errori durante la riparazione. Un'ulteriore mutazione presente in alcuni ceppi abitualmente utilizzati è la delezione di un gene coinvolto nella biosintesi della biotina (Δbio), che rende impossibile la sopravvivenza del batterio in terreni che ne siano privi; ciò consente di identificare eventuali contaminazioni del risultato finale sulla piastra (i batteri revertanti ottenuti dovranno risultare auxotrofi per la biotina).

Procedura sperimentale[modifica | modifica wikitesto]

Il test viene effettuato piastrando i batteri su un terreno solido di agar contenente una minima quantità di istidina, e ponendo al centro della piastra un disco contenente la sostanza in esame, che può in questo modo diffondersi nel terreno di coltura. La presenza delle tracce di amminoacido nel terreno permette di individuare mutazioni che richiedano più cicli di duplicazione cellulare per manifestarsi fenotipicamente, come nel caso di mutazioni puntiformi su una singola elica di DNA. La frequenza delle mutazioni ottenute viene valutata in base alla distanza dal disco dopo 48 ore di crescita, in rapporto ad una piastra di controllo in cui i batteri sono stati fatti crescere sullo stesso terreno, ma in assenza del sospetto mutageno; il raffronto delle due piastre consente di eliminare dal risultato del test l'effetto dovuto alla presenza di revertanti spontanei. Il test per una sostanza viene sempre condotto in parallelo su differenti ceppi di Salmonella, in cui l'auxotrofia è dovuta a differenti tipi di mutazioni (mutazioni puntiformi di diverso tipo, o mutazioni di frameshift come inserzioni o delezioni) per individuare il tipo di effetto causato al DNA.

Il limite principale del test, così descritto, è l'impossibilità di valutare l'effetto genotossico dei promutageni, ovvero sostanze che non presentano un proprio effetto mutageno, ma diventano tossiche a seguito del metabolismo subito negli organismi superiori; esempi di queste sostanze sono gli idrocarburi aromatici o le ammine aromatiche. Per superare questo problema, si utilizza un protocollo differente del test[2], che prevede la presenza nel terreno di coltura dell'estratto S9 di fegato di ratto, in cui sono presenti gli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici (principalmente isoforme del citocromo P450), che possono attivare l'effetto genotossico del promutageno. In questo caso la sostanza da esaminare viene aggiunta direttamente al terreno di coltura.

Limiti del test[modifica | modifica wikitesto]

Essendo condotto in cellule batteriche, il test di Ames non consente di valutare la capacità dei mutageni di alterare la struttura cromosomica del DNA umano, per cui non può da solo costituire un elemento sufficiente di valutazione del rischio genotossico, ma va eseguito insieme a test su cellule eucariotiche (test dei micronuclei, test della cometa, quantificazione degli addotti al DNA) e su animali in vivo. Vi è comunque una buona correlazione fra l'effetto mutageno riscontrato nel test di Ames e la cancerogeneità della sostanza negli organismi superiori.

Note[modifica | modifica wikitesto]

  1. ^ (EN) Bruce N. Ames, Frank D. Lee, William E. Durston, An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens in Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 70, nº 3, 1º marzo 1973, pp. 782-786, DOI:10.1073/pnas.70.3.782, PMID 4577135, PMC 433358.
  2. ^ (EN) Bruce N. Ames, William E. Durston, Edith Yamasaki, and Frank D. Lee, Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection in Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 70, nº 8, 1º agosto 1973, pp. 2281-2285, DOI:10.1073/pnas.70.8.2281, PMID 4151811, PMC 433718.
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