Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

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La tecnica della RT- PCR è una variante della tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) e consente di amplificare una molecola di DNA partendo da un insieme di RNA totali estratti da un tipo cellulare. Per tale motivo, la RT- PCR è una tecnica che viene sfruttata in laboratorio per studiare l'espressione genica.

La tecnica prevede lo svolgimento di due fasi:

  1. Retrotrascrizione dell' RNA (Reazione First-strand);
  2. Amplificazione del cDNA ottenuto nella prima fase (Reazione Second-strand).

Retrotrascrizione[modifica | modifica sorgente]

Per la retrotrascrizione, di rilevante importanza è la coda di circa 200 residui di adenina (coda poli-A) che solitamente gli RNA eucariotici presentano alla loro estremità 3'-OH, in seguito alla maturazione.

Innesco[modifica | modifica sorgente]

Incubando l' RNA totale (quindi contenente anche RNA ribosomale) estratto da una cellula, con l'enzima trascrittasi inversa, precursori deossiribonucleotidi trifosfato (dNTP), soluzione tampone e ioni bivalenti Mg2+ è possibile, in presenza della sequenza complementare oligo(dT), dare il via alla formazione di un filamento di cDNA (DNA copia o complementare), .

L'innesco o primer della reazione è l'oligo dT, una catena di circa venti residui di timina che si appaia alla coda di poliA secondo le regole della complementarità. L'appaiamento tra due filamenti singoli di acido nucleico in generale è definito annealing.

Allungamento[modifica | modifica sorgente]

Il primer fornisce un 3'-OH che la trascrittasi inversa usa per allungare la catena usando come stampo il trascritto. Questa seconda fase, detta di allungamento avviene alla temperatura di circa 50 °C in 1 ora.

Sintetizzato il primo filamento, prima di procedere con l'amplificazione del cDNA, viene aggiunto alla reazione l'enzima RNAsi (solitamente derivata dal batterio Escherichia coli) che degrada il filamento di RNA originale che è stato usato come stampo dalla trascrittasi inversa.

Amplificazione[modifica | modifica sorgente]

Exquisite-kfind.png Per approfondire, vedi Reazione a catena della polimerasi.

Quando la retrotrascrizione è completa, il cDNA generato viene amplificato tramite una metodica di PCR standard.

Una DNA polimerasi termostabile, un enzima con attività 5'→ 3' polimerasica viene aggiunta allo stampo di cDNA ed in presenza di una coppia di primer specifici per la sequenza del gene che si desidera amplificare, la reazione di PCR viene avviata. Se non si dispone della sequenza o se interessa l'amplificazione di tutto il DNA, il secondo primer sarà aspecifico in modo tale che si appai con l'estremità del primo filamento di DNA e di tutti i cDNA neosintetizzati.

Dapprima viene sintetizzata una molecola di DNA a doppio filamento a partire dalla molecola di cDNA, conducendo la reazione ad una temperatura adatta a permettere l'annealing dei primer al DNA. Successivamente portando la temperatura a 95 °C, la nuova molecola di DNA si denatura e i due filamenti così separati sono pronti per un nuovo appaiamento dei primer e per la sintesi da parte della polimerasi, ad un nuovo abbassamento della temperatura (72 °C circa 1000 bp/minuto). Dopo circa 30 cicli, saranno stati prodotti milioni di copie della sequenza di interesse.