Miniprep

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Corsa elettroforetica su gel di agarosio di DNA plasmidico estratto mediante miniprep. Il DNA è visualizzato grazie alla presenza nel gel di etidio bromuro.

La Miniprep (o minipreparazione di DNA plasmidico) è una tecnica di laboratorio utilizzata in biologia molecolare per l'estrazione, su piccola scala, di DNA plasmidico dai batteri trasformati che lo contengono. Le miniprep sono utilizzate durante i processi di clonaggio per analizzare cloni batterici.

Utilizzo[modifica | modifica sorgente]

L'uso di plasmidi permette di replicare il materiale genetico in batteri o per trasferire certi geni in altri organismi. La resa di plasmidi dipende tra l'altro il ceppo batterico, il terreno di coltura utilizzato, il tipo di plasmide (i cosiddetti plasmidi ad alto numero di copie, high copy number o a basso numero di copie, low copy number) e le condizioni di coltura (agitazione, temperatura...). I batteri generalmente utilizzati per la replicazione di plasmidi esogeni sono della specie Escherichia coli.

Tale tecnica è utile allorquando si vogliano utilizzare dei plasmidi come vettori di espressione o di clonaggio, per determinare, in genere dopo un passaggio di ligazione e di successiva trasformazione, quali cloni batterici contengano il plasmide di interesse.

Procedimento[modifica | modifica sorgente]

Esistono diverse vie per ottenere una miniprep: il metodo classico utilizza tutta una serie di soluzioni o buffer che servono a compiere i diversi step dell'estrazione (dalla rottura delle cellule fino all'ottenimento del DNA plasmidico). Questa tecnica si basa sul processo di lisi alcalina, proposta da Birnboim e Doly nel 1979.[1]

Attualmente nei laboratori di ricerca vengono utilizzati dei kit forniti da diverse industrie del settore contenenti, già preparate, le soluzioni per l'estrazione del DNA; per ragioni commerciali, la composizione di ogni singola soluzione non è nota.


Crescita dei batteri[modifica | modifica sorgente]

I plasmidi sono solitamente purificati a partire da colture liquide trasformate, seminate su terreno solido e isolate. I plasmidi ingegnerizzati sono solitamente dotati di uno o più geni in grado di conferire resistenza agli antibiotici (solitamente ampicillina o kanamicina, che permette ai batteri che sono stati trasformati con successo di moltiplicarsi in un terreno di coltura selettivo. Nelle miniprep il volume di terreno liquido è di circa 1-5ml.

Lisi[modifica | modifica sorgente]

I batteri di ogni campione, dopo essere stati risospesi in un tampone isotonico, subiscono la lisi alcalina grazie all'aggiunta di un tampone contenente idrossido di sodio 0,2N e la successiva neutralizzazione con l'addizione di un tampone contenente sodio acetato. L'idrossido di sodio, oltre a rompere la parete batterica, denatura il DNA. La fase di neutralizzazione, riportando il pH ai valori fisiologici, permette la rinaturazione del DNA plasmidico superavvolto ma non di quello genomico, a causa delle grandi dimensioni di quest'ultimo.[1]

Purificazione del DNA[modifica | modifica sorgente]

Dopo la centrifugazione dei campioni, che rimuove le membrane, le pareti cellulari e il DNA genomico, il DNA plasmidico in soluzione viene purificato tramite l'addizione di una soluzione fenolo/cloroformio: le proteine vengono denaturate e solubilizzate nella fase organica inferiore mentre il DNA plasmidico si colloca nella fase acquosa superiore.

La fase acquosa viene prelevata e si procede con la precipitazione del DNA addizionando etanolo. Dopo la precipitazione si rimuove l'etanolo e il DNA precipitato può essere risospeso in acqua o in un altro opportuno tampone.

Note[modifica | modifica sorgente]

  1. ^ a b J. Doly, H.C. Birnboim, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA in Nucleic Acids Res, vol. 7, nº 6, 1979, pp. 1513-1523, PMID 388356. URL consultato il 1 maggio 2013.
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