Microscopio ottico

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Un modello base di microscopio ottico composto di marca Leitz, ora Leica. Design industriale anni sessanta ma struttura concettualmente moderna. La messa a fuoco avviene variando la distanza preparato/obiettivo muovendo il preparato. Illuminatore incorporato nello strumento. 1 - Tubo verticale per fotografia; 2 - Oculare; 3 - Stativo; 4 - Revolver porta obbiettivi; 5 - Tavolino portaoggetti; 6 - Condensatore; 7 - Manopole di messa a fuoco; 8 - Sorgente di luce.

Il microscopio ottico è una tipologia di microscopio che sfrutta la luce con lunghezza d'onda dal vicino infrarosso all'ultravioletto, coprendo tutto lo spettro visibile. I microscopi ottici sono storicamente quelli più vecchi e sono anche tra i più semplici.

Il microscopio ottico a scansione in campo prossimo (SNOM) è un microscopio a scansione di sonda che consente di superare il limite risolutivo legato alla diffrazione (circa 0,2 μm con luce visibile).

Microscopi ottici e affini[modifica | modifica sorgente]

Disegno dell'ingrandimento del sughero osservato da Robert Hooke nel 1665 con un rudimentale microscopo ottico composto.

Il microscopio ottico (LM) tradizionale (LM acronimo di (EN) light microscope) è il più semplice. Per mezzo di lenti ingrandisce l'immagine del campione, illuminato con luce nell'intervallo spettrale del visibile.

Può essere semplice (un solo sistema di lenti o addirittura una sola lente) o composto (almeno due sistemi, oculare ed obiettivo), e l'illuminazione può raggiungere il campione da dietro, attraversandolo (luce trasmessa), o esserne riflessa (luce riflessa). Il microscopio ottico permette di avere immagini di soggetti dimensionalmente collocati all'incirca tra il millimetro ed il micrometro, anche di esseri viventi. I primi esempi di ingrandimento ottico datano migliaia di anni e risalgono alle civiltà mesopotamiche. Nel 1648 Antoni van Leeuwenhoek osservò e descrisse numerosi microorganismi, utilizzando un microscopio semplice, inizialmente dotato di pochi ingrandimenti e poi perfezionato fino a raggiungerne alcune centinaia (275 accertati, 500 ipotizzati). Nel 1665 Robert Hooke, utilizzando una forma molto rudimentale di microscopio ottico composto, con un limitato potere di ingrandimento ed osservando il sughero vide e descrisse per la prima volta la struttura cellulare propria di tutti i viventi.

Si considerano nella classe dei microscopi ottici anche strumenti affini, come i microscopi nell'ultravioletto, che benché sfruttino frequenze non visibili hanno principi e tecnologie simili.

Monoculari e Binoculari[modifica | modifica sorgente]

In testa alla lista delle tipologie strumentali va premesso che ogni microscopio a visione diretta può essere fornito di un solo oculare di osservazione, come pure di un sistema per la visione binoculare, con entrambi gli occhi. I modelli monoculari permettono uno schema costruttivo più semplice ed economico, riducono le perdite di luminosità, permettono con semplicità di proiettare l'immagine su un sistema di registrazione della stessa. I sistemi binoculari permettono a scapito della semplicità costruttiva e dell'economicità una visione più comoda, specie per lunghi periodi d'osservazione. I sistemi stereoscopici sono ovviamente obbligatoriamente binoculari. Costruttivamente, le teste binoculari, o multioculari, nel caso di ulteriori deviazioni a strumenti di ripresa e misura, vengono realizzate con sistemi ottici di prismi, che prima suddividono il fascio luminoso, in genere con un sistema di prismi triangolari incollati e poi, nei due percorsi ottici lo riportano con un sistema di prismi di Porro o di Porro-Abbe, sul piano focale dei due oculari. Il sistema induce ovviamente ulteriori aberrazioni, dovute in massima parte alle proprietà di dispersione ottica degli elementi, che devono essere dovutamente valutate calcolate e compensate.

Fenomeni di sommatoria binoculare, ovvero dove la soglia di rilevamento di uno stimolo è più bassa con due occhi che con uno inducono ulteriormente a diffondere i sistemi binoculari. Ci sono due forme. In primo luogo, quando si cerca di rilevare un segnale debole, c'è un vantaggio statistico nell'utilizzare due rivelatori. Matematicamente, il vantaggio è uguale alla radice quadrata di 2, circa 1.41. In secondo luogo, quando alcune cellule della corteccia visiva ricevono segnali da entrambi gli occhi contemporaneamente, essi mostrano l'agevolazione binoculare, un maggiore livello di attività rispetto alla somma delle due attività evocate separatamente da ciascun occhio. Il vantaggio d'usare due occhi con attività di rilevazione 1,41 è chiamato sommatoria neurale.

Fenomeni d'interazione binoculare, oltre alla sommatoria bioculare possono inoltre influenzare a vicenda i due occhi in almeno tre modi:

  • Diametro pupillare.
  • Sistemazione e convergenza
  • Trasferimento endoculare

Questi fenomeni spiegano in gran parte la spontanea preferenza nell'utilizzo dei sistemi binoculari, specie nell'uso prolungato.

Microscopio semplice a luce trasmessa[modifica | modifica sorgente]

Come nei primi esemplari di van Leeuwenhoek si tratta di una semplice lente o sistema di lenti (un doppietto frequentemente) con una serie di supporti per il campione ed un sistema elementare di spostamento dell'ottica per la messa a fuoco.

Microscopio semplice a luce riflessa[modifica | modifica sorgente]

Come il precedente, l'illuminazione in questo caso è frontale o laterale, il caso tipico è la lente contafili in uso in filatelia e nel controllo dei filati dell'industria tessile.

Microscopio composto a luce trasmessa[modifica | modifica sorgente]

È un microscopio che, permette di vedere i particolari del campione utilizzando luce trasmessa attraverso lo stesso, proveniente da una piccola lampadina incorporata o indirizzata tramite uno specchio da una sorgente esterna. Rappresenta il microscopio per antonomasia, e viene utilizzato largamente in applicazioni didattiche, scientifiche, tecniche ed industriali in un intervallo di ingrandimenti compreso generalmente tra le decine ed il migliaio. Nei primi esemplari storici si utilizzava luce diurna o luce proveniente da una candela o lampada ad olio. Negli esemplari di uso corrente la sorgente più convenientemente utilizzata è una lampada alogena. Da notare che nei microscopi composti, in genere senza particolari accorgimenti l'immagine osservata risulta invertita.

Microscopio composto a luce riflessa[modifica | modifica sorgente]

Stereomicroscopio a basso ingrandimento. Permette la visione stereoscopica del campione ed è usato per studi di Sistematica, per piccole dissezioni, per la conta delle colonie batteriche e per la preparazione dei pezzi da osservare poi con gli altri più potenti tipi di microscopio. Questo strumento è anche molto usato nelle indagini della Polizia scientifica.

Come il precedente, l'illuminazione in questo caso proviene dall'alto, tramite diversi sistemi. Focalizzazione della sorgente tramite specchi, sistemi a fibre ottiche, LED, epi-illuminazione (che sfrutta lo stesso obiettivo anche per illuminare il campione).

Stereomicroscopio[modifica | modifica sorgente]

Exquisite-kfind.png Per approfondire, vedi Microscopio stereoscopico.

Lo Stereomicroscopio (Microscopio stereoscopico o Stereoscopio) è un microscopio che si avvale in realtà di due diversi e distinti microscopi, in generale composti, ed a basso ingrandimento, formanti tra loro un certo angolo. L'osservazione, particolarmente in luce riflessa, produce un'immagine tridimensionale come la visione diretta, eliminando l'effetto di appiattimento tipico degli altri tipi di microscopi. In genere sono dotati di un sistema di prismi ottici per il raddrizzamento dell'immagine, e quindi l'eventuale manipolazione corretta del campione, senza le consuete inversioni destra-sinistra tipiche dei microscopi composti. Sono per questo utilizzati nell'industria (micro-componentistica), nella dissezione, nella micro-chirurgia ecc.

Microscopio polarizzatore[modifica | modifica sorgente]

Exquisite-kfind.png Per approfondire, vedi Microscopio polarizzatore.

Il microscopio polarizzatore sfrutta un fascio di luce polarizzata di dato orientamento che attraversa il corpo del preparato, posto su un tavolino rotante, per venire poi analizzato da un secondo filtro polarizzatore, anch'esso orientabile e in genere posto sul piano posteriore dell'obiettivo. Questo tipo di microscopio è molto utilizzato in petrografia, cioè nello studio delle rocce e dei minerali che le compongono. La microscopia in luce polarizzata utilizza onde ciascuna delle quali oscilla in un piano, detto piano di vibrazione o piano di polarizzazione che è perpendicolare alla direzione di propagazione dell’onda stessa. In un raggio di luce normale le onde oscillano in tutti i possibili piani. Definiamo polarizzato un raggio di luce formato da onde i cui piani di vibrazione sono tutti orientati in un’unica direzione, sono cioè paralleli fra loro.

Microscopio a contrasto di fase[modifica | modifica sorgente]

È un tipo particolare di microscopio che analogamente al microscopio a luce trasmessa lavora nel campo del visibile. Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa.

Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso a livello del condensatore in due porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza. Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla porzione di luce che attraversa il campione, andandosi a ricombinare con la luce non rifratta renderà visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo. In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua, tuttavia vediamo che le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule mantenute in vita in apposite colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. La tecnica in questione fu messa a punto dal fisico olandese Frederik Zernike (Frits Zernike) negli anni trenta e gli valse il Premio Nobel per la fisica nel 1953.[1]

Microscopio ad interferenza[modifica | modifica sorgente]

Si attua con due treni di onde completamente separate e tramite due diversi percorsi ottici: uno attraversa il preparato che lo sfasa, indi si incontra con il secondo non sfasato, dando luogo a fenomeni di interferenza. Queste forniscono notizie utili, anche quantitative, sui componenti presenti nel campione.

Microscopio Leica DMRX a luce incidente con componenti meccaniche e contatore automatico di punti Swift F per l'analisi della composizione organica di campioni di roccia e carbone.

Microscopio a contrasto interferenziale[modifica | modifica sorgente]

Analogamente al contrasto di fase è utilizzato per osservare strutture trasparenti non altrimenti visibili in campo chiaro. Combina effetti di interferenza e di polarizzazione e fornisce immagini più contrastate e con un effetto di tipo tridimensionale. Questo metodo di contrasto è conosciuto anche con il nome di "DIC" (differential interference contrast). Una delle due tecnologie più utilizzate è la Nomarski, dal nome dell'inventore della configurazione ottica che si ritrova in diffusi microscopi odierni a contrasto interferenziale.

Ultramicroscopio[modifica | modifica sorgente]

L'ultramicroscopio ed il microscopio in campo oscuro, sono microscopi ottici con un condensatore paraboloide, con pareti a specchio, o comunque munito di uno schermo anulare che ferma i raggi che illuminerebbero direttamente il preparato. Vengono raccolti dall'obiettivo solo i raggi che vengono opportunamente deviati (rifratti) oppure diffratti. La diffrazione (deviazione dei fotoni a onde decrescenti rispetto alla traiettoria principale) viene operata da particelle del preparato che abbiano dimensioni submicroscopiche comprese fra 0,1 micrometro e 1 nanometro, particelle che, pur sotto la soglia di risoluzione del microscopio, appariranno come punti luminosi su sfondo buio, senza dettagli morfologici (effetto Tyndall).

Microscopio a fluorescenza[modifica | modifica sorgente]

Strutturalmente esisterebbero sistemi a luce trasmessa e riflessa, ma per motivi tecnici i primi sono stati relegati ad usi limitati, su campioni opachi. La maggior parte della produzione ed uso prevede sistemi ad epifluorescenza. Questo tipo di microscopio serve per osservare preparati naturalmente fluorescenti, o legati con molecole fluorescenti o rese tali da particolari coloranti detti fluorocromi. Questi composti vanno selettivamente a legarsi con strutture cellulari definite.
La sorgente luminosa (alogena di alta potenza, lampada di Wood, lampada ad arco e scarica di gas e più recentemente diodi LED ad alta efficienza e laser), che trasmette radiazioni ultraviolette, o comunque di bassa lunghezza d'onda nel visibile, eccita il preparato generalmente dall'alto (sistemi ad epifluorescenza). Le componenti del preparato emettono luce di lunghezza d'onda maggiore di quella emessa dalla sorgente luminosa. Questo fenomeno è conosciuto come fluorescenza.
Attualmente gli utilizzi più diffusi prevedono l'utilizzo di anticorpi specifici, appositamente prodotti per andare a legarsi con determinate molecole nel campione (che rappresentano l'antigene) utilizzando fluoresceina, rodamina, ed altre simili molecole come fluorocromo legato all'anticorpo per renderlo appunto fluorescente e visibile. Nell'osservazione è fondamentale l'utilizzo corretto dei filtri ottici per selezionare la giusta lunghezza d'onda di eccitazione, la giusta lunghezza d'onda di emissione visibile, e l'arresto della radiazione ultravioletta che danneggerebbe l'occhio dell'osservatore. Gli obiettivi microscopici usati per questo tipo di osservazione non devono contenere lenti che presentino fenomeni di autofluorescenza (come spesso succede per quelli alla fluorite), devono trasmettere l'ultravioletto (se in epifluorescenza, visto che l'illuminazione passa attraverso l'obiettivo), mentre il grado di correzione cromatico è poco influente sulla qualità dell'immagine, per cui vanno generalmente bene le ottiche acromatiche.

Il Vertico SMI combina infine la microscopia con la modulazione spaziale dell'illuminazione raggiungendo risoluzioni inferiori ai 10 nanometri (1 nanometro = 1 nm = 1 × 10−9 m).[2][3][4].

Microscopio confocale[modifica | modifica sorgente]

Exquisite-kfind.png Per approfondire, vedi Microscopio confocale.
Immagine al confocale. La tubulina di alcune cellule di endotelio colorata in verde da anticorpi coniugati alla fluoresceina, la actina colorata da Texas red coniugato alla falloidina in rosso, ed il dna colorato in azzurro dal DAPI

Il microscopio confocale si basa su una tecnologia ottica volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato.

Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante (Nipkow disk), Programmable Array Microscopes (PAM), e laser. Quest'ultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di Confocal Laser Scanning Microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo. La sua sorgente luminosa è costituita uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza d'eccitazione. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di relazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare in diversi colori diverse molecole presenti nel preparato, permettendone di apprezzarne la tridimensionalità (esempio actina in rosso tubulina del citoscheletro in verde e DNA del nucleo in blu).

Microscopio nell'ultravioletto[modifica | modifica sorgente]

Il limite principale della microscopia ottica sta nella risoluzione massima, strettamente legata al fenomeno della diffrazione. Il criterio di Abbe limita la risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per un sistema ottico avente apertura numerica n sin θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ. Per luce nello spettro visibile essa si attesta circa a 0,2 µm, dati i limiti teorici imposti dalla massima apertura numerica di una lente. Un sistema per superare il limite è spostarsi su lunghezze d'onda nello spettro appartenente all'ultravioletto. Si riesce così ad incrementare notevolmente la risoluzione, ma i problemi tecnici derivanti dalla non visibilità dell'ultravioletto (occorrono schermi fluorescenti o la fotografia dell'immagine), alla trasparenza delle ottiche (in quarzo), ed alla dannosità della radiazione per gli organismi viventi, con l'avvento dei microscopi elettronici a basso costo hanno limitato molto ulteriori sviluppi di questo strumento.

Note[modifica | modifica sorgente]

  1. ^ "How I discovered phase contrast" Frits Zernike Nobel Lecture, December 11, 1953
  2. ^ Nano-structure analysis using Spatially Modulated Illumination microscopy: D. Baddeley, C. Batram, Y. Weiland, C. Cremer, U.J. Birk in NATURE PROTOCOLS, Vol 2, pp. 2640–2646 (2007)
  3. ^ High-precision structural analysis of subnuclear complexes in fixed and live cells via Spatially Modulated Illumination (SMI) microscopy: J. Reymann, D. Baddeley, P. Lemmer, W. Stadter, T. Jegou, K. Rippe, C. Cremer, U. Birk in CHROMOSOME RESEARCH, Vol. 16, pp. 367 –382 (2008)
  4. ^ SPDM – Light Microscopy with Single Molecule Resolution at the Nanoscale: P. Lemmer, M.Gunkel, D.Baddeley, R. Kaufmann, A. Urich, Y. Weiland, J.Reymann, P. Müller, M. Hausmann, C. Cremer in APPLIED PHYSICS B, Vol 93, pp. 1-12 (2008).

Bibliografia[modifica | modifica sorgente]

  • Stephen G. Lipson, Henry Lipson, David Stefan Tannhauser, Optical Physics 3th Edition, Cambridge University Press, 1995, ISBN 9780521430470

Collegamenti esterni[modifica | modifica sorgente]