Immunofluorescenza

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L’immunofluorescenza è una delle tecniche più usate tra le reazioni sierologiche, di fondamentale importanza in microbiologia, immunologia, o comunque nel laboratorio biomedico, per rilevare in un certo campione la presenza di specifici antigeni od anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) è variamente legata ad un marcatore. Il marcatore è un fluorocromo, ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (ultravioletti) emette nel visibile. Il fluorocromo più impiegato è l’isotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti, dunque con l’ausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta, emette luce verde. Esistono due principali metodiche che utilizzano il principio dell’immunofluorescenza, quella diretta e quella indiretta.

Immunofluorescenza diretta[modifica | modifica wikitesto]

Quando cerchiamo un antigene corpuscolato ignoto (batterio, cellula, …), fissiamo con apposite metodiche l’antigene al vetrino (o pozzetto), poi vi mettiamo a contatto i presunti anticorpi specifici marcati con fluorescina (eventualmente dovremo usare diversi anticorpi in ricerche successive). Lasciamo a contatto per il tempo necessario all’interazione antigene-anticorpo, poi laviamo accuratamente. In questo modo gli anticorpi fluorescenti non legati verranno eliminati. Se al microscopio visualizzeremo corpuscoli fluorescenti (verdi brillanti), su uno sfondo scuro e incolore, significa che l’antisiero (il siero contenente anticorpi fluorescenti) è specifico per quell’antigene. Avremo quindi risultato positivo.

Tale tecnica non ci permette invece di ricercare anticorpi specifici in un siero prelevato da un soggetto. A tal fine ci viene, invece, in aiuto la immunofluorescenza indiretta.

Immunofluorescenza indiretta[modifica | modifica wikitesto]

Possiamo usarla per ricercare un antigene od un anticorpo ignoto.

Nella ricerca dell’antigene ignoto (Ag?), fissiamo questo come nella precedente metodica. Poi mettiamo a contatto con un antisiero specifico (conosciuto) non marcato (Ab I), si formerà l’eventuale immunocomplesso primario. Laviamo, portando via tutti gli anticorpi che non si sono legati. Aggiungiamo un altro antisiero anti-immunoglobuline, della specie da cui proviene il primo antisiero specifico usato, marcato con fluorescina (ovvero anticorpi anti-anticorpi AbIg II*); se nel preparato sono rimasti anticorpi dopo il primo lavaggio, avremo la formazione di un immunocomplesso secondario (cioè gli AbIg II* si legheranno agli Ab I che si erano legati all’Ag). Laviamo ancora una volta. Se osservando il preparato all’ultavioletto noteremo la fluorescenza significa che l’antigene presente nel materiale in esame è quello per l'anticorpo specifico Ab I.

Nella ricerca dell'anticorpo ignoto (Ab?), mettiamo il siero in esame a contatto con antigeni noti (Ag) fissati ad un vetrino. Si formerà l’eventuale immunocoplesso primario. Dopo un accurato lavaggio, aggiungiamo un antisiero anti-immunoglobuline, della specie da cui proviene il siero in esame, marcato con fluorescina (AbIg II*), se nel preparato sono rimasti anticorpi dopo il primo lavaggio, avremo la formazione di un immunocomplesso secondario (cioè gli AbIg II* si legheranno agli Ab? che si erano legati all’Ag noto). Laviamo ancora una volta. Se osservando il preparato all’ultavioletto noteremo la fluorescenza significa che l'anticorpo ricercato è specifico per l’antigene a noi noto.

I vantaggi della tecnica indiretta sono vari. Primo fra tutti la necessità di usare un solo tipo di anticorpi marcati con fluorescina, cioè quelli anti-immunoglobuline, i quali vengono prodotti industrialmente ed acquistati dai laboratori. La ricerca diretta, se fosse applicata sempre, prevedrebbe che ogni laboratorio si dotasse di centinaia di antisieri specifici fluorescenti, risultando in un costo spropositato. Altro vantaggio risulta il fatto che ad ogni anticorpo primario “nudo”, legato all’antigene fissato, si leghino (alle porzioni costanti Fc dell’Ab I) più anticorpi secondari marcati, risultando così in una amplificazione della luminosità.

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