Trinder end point

Il metodo Trinder end point è un test medico basato su una procedura enzimatico colorimetrica, per quantificare e identificare la presenza di colesterolo, glicemia, trigliceridi, zuccheri e altre sostanze specifiche in una soluzione.

Il metodo di Trinder ha come finalità la produzione di acqua ossigenata (H₂O₂) che verrà perossidata per formare un composto colorato la cui densità è direttamente proporzionale alla quantità di sostanza presente nel campione. La produzione di H₂O₂ proviene da molti composti biochimici presenti nel plasma o nel siero, attraverso diversi tipi di reattivi, ma l'ultima reazione di perossidasi è uguale per tutti i campioni e appunto per questo è definita "end point" ("punto finale" in inglese).

Determinazione del colesterolo

Per quanto riguarda il colesterolo, il metodo permette la sola determinazione del colesterolo totale, visto che gli esteri del colesterolo sono idrolizzati, e che successivamente, insieme a quelli non esterificati, verranno ossidati per formare H₂O₂. Dopo che è avvenuta la produzione di H₂O₂ si ha quindi la sua trasformazione in acqua e complesso chinonico colorato, avvenuta grazie alla reazione del cromogeno specifico per la determinazione e l'enzima perossidasi (POD).

I campioni di siero o plasma vengono aggiunti al reattivo contenente colesterolo esteri idrolasi, colesterolo ossidasi, perossidasi, acido 3,5-dicloro-2-idrossibenzen-solfonico (DHBS) e 4-aminoantipirina.

Determinazione del glucosio

Anche per determinare la quantità di glucosio nel sangue e nelle urine si utilizza il test Trinder o GOD-POD. Per effettuarlo sono necessari due enzimi: il GOD (glucosio ossidasi) e il POD (perossidasi). Il primo enzima è estratto dall'Aspergillus niger, un genere di funghi della famiglia Trichocomaceae che comprende circa 200 muffe, e catalizza specificamente l'ossidazione del D-glucosio (Glu) formando acido gluconico (un acido aldonico con formula bruta C₆ H₁₂ O₇) e la produzione stechiometrica di perossido di idrogeno (H₂O₂), attraverso l'intermedio D-glucono-1,5-lattone che si idrolizza spontaneamente formando così l'acido.

Glu + O₂ + H₂O → Acido gluconico + H₂O₂

L' H₂O₂ viene ridotta ad acqua dal secondo enzima, la POD, un enzima di origine vegetale estratto dall'Armoraica rusticona o rafano, ossidando il 4-amminofenazone (C₁₃H₁₇N₂O) e il fenolo (C₆H₆O), composto aromatico derivante dal benzene, per formare il chinone più acqua. Questa sostanza assume una colorazione rossastra la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di glucosio.

2H₂O₂ + fenolo + 4-amminofenazone → chinone + 4H₂O

Per ottenere informazioni relative alla quantità di glucosio del campione si applica la legge di Lambert-Beer che descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche. L'assorbanza è correlata alla frazione di energia radiante assorbita dal campione mediante la formula:

A = Ɛ x d x C

dove la Ɛ è il coefficiente di estinzione molare (mM^-1 x cm^-1), d è il cammino ottico della soluzione (cm) e la C è la concentrazione del soluto (mM). La determinazione della quantità di glucosio mediante il metodo GOD-POD è utilizzata nei sistemi di analisi automatizzata che consentono di analizzare in successione numerosi campioni. I valori normali di glucosio nel sangue sono tra i 76 e i 110 mg/dl mentre valori oltre i 200 mg/dl sono da considerarsi sintomi del diabete. (In condizioni di digiuno).

Bibliografia

• P. Trinder, Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase system with a non-carcinogenic chromogen, J. Clin. Pathol., 22, 2, 1969, pp. 158-161