Denaturazione del DNA

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La denaturazione del DNA, detta anche DNA melting, è il processo per cui l'acido desossiribonucleico a doppio filamento (dsDNA double-stranded DNA) si svolge e si separa in due filamenti singoli (ssDNA single-stranded DNA) rompendo i legami idrogeno tra le basi appaiate. Entrambi i termini “melting” e “denaturazione” sono usati per indicare il processo che avviene sottoponendo il materiale genetico al calore, mentre si usa “denaturazione” per indicare la separazione dei filamenti dovuta all’uso di reagenti chimici come l’urea. Quando abbiamo diverse copie di molecole di dsDNA la Temperatura di melting (Tm) è definita come la temperatura alla quale la metà del DNA si trova nello stato a doppia elica, e la metà in quello denaturato (random-coil).[1] La temperatura di melting dipende sia dalla lunghezza totale della molecola di DNA, sia dalla specifica sequenza dei nucleotidi.

Applicazioni della denaturazione del DNA[modifica | modifica sorgente]

Questo processo può essere utilizzato per analizzare taluni aspetti del DNA. Poiché l’appaiamento citosina/guanina è più forte di quello adenina/timina, la quantità di CG in un genoma può essere stimata misurando la temperatura di melting di tale genoma (risulterà più alta, a parità di lunghezza, in quei DNA dove CG siano abbondanti).[2]

Inoltre il processo di melting è fondamentale nelle tecniche di biologia molecolare, tra cui la diffusissima PCR (reazione a catena della polimerasi).

Metodi per determinare la Tm[modifica | modifica sorgente]

Varie formule vengono usate per stimare i valori di Tm.[3][4] Alcune formule sono più accurate di altre nel predire la temperatura di melting dei duplex di DNA.[5]

Metodo di Wallace[modifica | modifica sorgente]

Il Metodo Wallace è il più veloce, e meno accurato, metodo utilizzabile per gli oligonucleotidi di lunghezza inferiore a 18 coppie di basi. Si attua contando la frequenza di ciascun tipo di nucleotide (A, T, C o G). Il fondamento di questo metodo è che gli appaiamenti citosina-guanina sono composti da tre legami idrogeno, mentre gli appaiamenti adenina-timina solo da due, dunque le coppie CG contribuiscono di più alla stabilità della doppia elica.

T_m = 2(A+T) + 4(G+C)

Metodo Nearest-neighbor[modifica | modifica sorgente]

Il Metodo Nearest-neighbor ("vicino più prossimo") è decisamente il più accurato per predire la temperatura di melting dei dsDNA. Sebbene il contenuto di CG giochi un ruolo preponderante nell'energia di ibridazione dei dsDNA, l’interazione tra le basi viciniori lungo l’elica forniscono una notevole energia di embricazione. Il modello Nearest-neighbor, per tener conto di ciò, considera le basi adiacenti lungo l’elica due a due.[1] Ciascuna di queste ha dei parametri entalpici ed entropici, la somma dei quali determina la Tm secondo la seguente equazione:

T_\mbox{m}=\frac{\Delta H }{\Delta S+R \ln(C_1-\frac{C_2}{2})}-273.15 \ ^\circ \mbox{C}
dove
\Delta H è l’entalpia standard e \Delta S è l’entropia standard per la formazione di duplex da due singoli filamenti,
C_1 è la concentrazione iniziale del filamento singolo che è in eccesso (di norma le sonde o i primer),
C_2 è la concentrazione iniziale del filamento singolo in difetto (di norma il DNA target),
R è la costante universale dei gas \left (\mbox{1.987}\frac{\mbox{cal}}{\mbox{mol} \cdot \mbox{K}} \right).

Entalpia e entropia standard sono negative per la reazione di annealing e sono assunte come temperature indipendenti. Se C_1 >> C_2 allora C_2 può essere trascurato.

Tavola 1. Parametri unificati di Nearest-neighbor per duplex DNA/DNA.[1] Si noti che i valori di \Delta H sono dati in kilocalorie per mole, mentre i valori di \Delta S sono dati in calorie per mole per kelvin.

Sequenza Nearest-neighbor
(5'-3'/5'-3')
\Delta H
kcal/mol
\Delta S
cal/(mol·K)
AA/TT -7.9 -22.2
AG/CT -7.8 -21.0
AT/AT -7.2 -20.4
AC/GT -8.4 -22.4
GA/TC -8.2 -22.2
GG/CC -8.0 -19.9
GC/GC -9.8 -24.4
TA/TA -7.2 -21.3
TG/CA -8.5 -22.7
CG/CG -10.6 -27.2
Coppia di basi A-T terminale 2.3 4.1
Coppia di basi G-C terminale 0.1 -2.8

Note[modifica | modifica sorgente]

  1. ^ a b c John SantaLucia Jr., A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, nº 4, 1998, pp. 1460-5.[1]
  2. ^ M. Mandel and J. Marmur, Use of Ultravialet Absorbance-Temperature Profile for Determining the Guanine plus Cytosine Content of DNA in Methods in Enzymology, vol. 12, nº 2, 1968, ISBN 978-0-12-181856-2.
  3. ^ Breslauer, K.J. et al., Predicting DNA Duplex Stability from the Base Sequence in Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 83, 1986, pp. 3746-3750. (pdf)
  4. ^ Rychlik, W. et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412.
  5. ^ Owczarzy R., Vallone P.M., Gallo F.J., Paner T.M., Lane M.J. and Benight A.S, Predicting sequence-dependent melting stability of short duplex DNA oligomers in Biopolymers, vol. 44, 1997, pp. 217-239. (pdf)

Voci correlate[modifica | modifica sorgente]

Collegamenti esterni[modifica | modifica sorgente]

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